[农学]基因工程 第8章 PCR技术.ppt
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1、Chapter 8 PCR technology,PCR polymerase chain reaction,Another cloning method Selective amplification of a DNA sequence. In some situation, it essentially replaces traditional cloning methodology.,PCR principle PCR: A technique to selectively amplify a specific region of DNA. A method like DNA repli
2、cation in vivo. template:ssDNA or dsDNA primers:oligo-nucleotides substrates: dNTP DNA polymerase: Taq poly, Basic principle:DNA thynthesing template/primer/DNA poly Application: themal-resistance DNA polymerase,DNA amplification Principle,dATP dGTP dCTP dTTP,Mg2+,buffer,5 3,3 5,template,primer,DNA
3、polymerase,denature,annealing,extension,dsDNA ssDAN,92-96C,37-72 C,50-58 C,72 C,3Reaction,PCR reaction mixture 1缓冲液 buffer (1) 50Mm (大于500bp) (70-100Mm , 小于500bp) KCl 引物退火 annealing 10mM TrisHCl pH 8.3-9.0 1.5mM MgCl2 (0.5-2.5) Stored in 20,2. dNTP Final concentration 0.2mM (即饱和浓度) pH7.0 (浓度大于4mM可能抑
4、制扩增反应) 4种dNTP 应平衡,提高忠实性 使用时应考虑Mg2+, 引物,产量之间的关系 如序列分析和制备探针时,用20-40m,3. Primers (正反向、同源互补、正反义) Each 1m(1pmol/l) OD260 dsDNA 50g/ml ssDNA 40g/ml oligo 33g/ml Primer design 16bp, frequently 20-30bp Tm=81.5+16.61ogJ+0.41(G+C)%-(675/N) N: length of strand J: concentration of monovalent ion If N=20 G+C%=55
5、% J+=60mmol/L then Tm=81.5-20.3+22.6-33.75=50.05,Tm=(G+C)4+(A+T)2 for short primers,Operon 公司 http:/, 避免二级结构的形成 二聚体 二级结构 G/C和A/T分布尽量均匀,一般G+C%45-55% oligo dT /oligo dC 除外, 其它,如5末端,限制酶位点的长度 rondom primers 随机引物 6nt 10-12nt,4. Template g or ng 102 -105 1g 人类单拷贝基因组DNA 3105 targets 10ng yeast DNA 3105 1ng
6、 E.coli DNA 3105 1ng 1kb DNA 9 106 1% M13 plaque 106,5. DNA polymerase 1-2U 早期使用klenow (1) Taq DNA polymerase, 75, 94kDa Thermus aquticus 嗜热水生菌,水生栖热菌 5 - 3polymeration and 5 - 3 exonuclease,Taq half-time 2hr 92.5 40min 95 5min 97.5,(2) Tth DNA polymerase Thermus thermophilus HB8, 94kDa, Mg2+: 5 -3合成
7、DNA Mn2+: 以RNA为模板合成cDNA 可解决RNA反转录过程中形成的二级结构 反转录: primer extension, cDNA合成,(3) DNA polymerase with 3- 5exonuclease and themal-resistance A. Vent DNA poly (New England Blabs) Thermococcus litoralis, 85kDa Half-life: 1.8hr at 100 (使用MgSO4) but Taq 5min,B. Tli DNA poly (Promega) 85kDa 来源同Vent CPwo Pyroc
8、occus woesei (BM- Roche) 90kDa Half-life 2hr at 100 5min for Taq D. Pfu Pyrococcus furiosus 激烈热球菌(stratagene) E. 商用混合酶,pfu Ideal for high-fidelity amplification Lowest error rate of any thermostable DNA polymerase studied One of the most thermostable DNA polymerases known Lack of extendase activity
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