克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用.ppt
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1、克隆性基因重排在淋巴瘤诊断中的应用,分子和细胞遗传学异常,抗原受体基因的克隆性重排 与类型相关的染色体异常,简要原理 检测方法 应用和策略 注意事项,淋巴细胞表面受体,IG: IGH (14q32) IGL (2q12) (22q11) TCR: TCR 14q11 TCR 7q32 TCR 7p15 TCR 14q11.2,IG和TCR基因结构及重排过程,胚系,各区片段数多 重排的多样性 抗体多样性,淋巴细胞发育过程中基因重排顺序,IG: H重排: IgH/ 缺失 : IgH/ TCR: :TCR :TCR ,淋巴瘤中基因重排形式 克隆性重排,不同的淋巴细胞 相同的重排形式 淋巴细胞单克隆性
2、增生 淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子指标,克隆性重排的检测方法,Southern 杂交 PCR法,特异性探针: 胚系的特征性片段外 另一不同大小的片段,Southern 杂交,优点: 敏感性较高 可靠性高 缺点: DNA量多(10ug) 新鲜组织 操作复杂 时间长、成本高 放射性同位素 逐渐被PCR方法替代,PCR法,原理: VDJ重排 后相互靠拢,用适当的引物可扩增出重排片段,新鲜、冻存、石蜡、显微切割或细胞学标本, 不受DNA片段的影响,仅需要少量的DNA, 时间短,敏感性高, 是目前最常用的克隆性重排的检测方法。,引物的选择原则,引物位置:PCR产物长度10-15bp 引物本身的长度25bp
3、 精确地将所有VDJ基因片段捡出 家族性引物或通用引物 不同的组合具有互补性,提高阳性率 引物数目和同源性之间平衡,该协作研究由47个研究所组成7个网络和一个病理panel。它由分子生物学、免疫学、血液学、病理学等领域的专家。 1998.6-2002.7, 12次国际性会议。 主要目的: (1)开发和标准化PCR实验操作和PCR引物 (2) 评价和应用该标准化方法,BMH4CT983936的欧洲BIOMED2 协作研究,设计了一套完整的引物和方法用于IG和TCR基因重排的克隆性分析,共有14管97对引物 IGH(A,B,C,D,E 5管) IGK(A,B 2管) IGL(1管) TCRB(A,
4、B,C 3管) TCRG(A,B 2管) TCRD(1 管) Van Dongen JJM et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the Biomed-2 concerted action BMH4-C98-3936 Leukemia 2003;17:2257-231
5、7,所有引物采用相同的扩增条件和检测方法,并具有很高的敏感性和特异性, 已被推荐为可疑淋巴组织增生性疾病克隆性分析的标准方法,试剂已商品化 http:/ 条带在期望的碱基大小范围内;一条或两条 带宽不超过1mm, 边缘整齐; 多克隆性: 无特异性条带,弥散带或梯状带,聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)-异源双链分析,+,-,2. 毛细管电泳基因扫描(genescan),单克隆性细胞产生一个或两个尖的峰,多克隆为多个小峰,呈Gaussian分布。 (本课题组曾用两种方法分析180管皮肤淋巴瘤的TCR基因重排,两者的符合率为96.7%, 在TCRB用genescan方法稍敏感,在TCRD用PAGE更特
6、异。),对照的设立,阳性对照 阴性对照,内对照: 3个病例的内对照b-actin均为阳性,对照的设立,克隆性基因重排的应用,诊断与鉴别诊断 谱系确定 分期 克隆相关性判断,(1)形态和IHC不能得出肯定结论的淋巴组织增生性病变 胃肠道、肺、涎腺、甲状腺、眼眶等部位的MALT淋巴瘤 滤泡性淋巴瘤、皮肤淋巴瘤和T细胞淋巴瘤 形态不典型,缺乏特异性标记,CP2170, 66M, 胃黏膜活检 CP2171, 43F, 左腮腺肿块,明显的浆样分化细胞,CP2170 : FR1 (+), FR2(+), FR3(+) 诊断: (胃)小B细胞淋巴瘤,倾向MALT边缘区B细胞淋巴瘤 CP2171: FR1 (
7、+), FR2(+), FR3(-) 诊断:(左腮腺)符合MALT边缘区B细胞淋巴瘤,(2) 形态和免疫组化均可考虑为淋巴瘤 但部位少见或发病年龄不典型 基因重排克隆性分析可增加诊断的依据,54M, 舌跟部肿块, PTCL 1M, 左颈鸡蛋大肿块, PTCL? 17 F, 右颈部淋巴结 FL 38M, 左颈部淋巴结 AILT,17F, 右颈淋巴结肿大,- + - + - + - +,CD20,Bcl-2,3. 组织小或无法取得组织病变的诊断,深部肿块的穿刺或活检标本如胃镜标本 无明显肿块,仅表现为胸腹水 但要特别注意细胞的量,52M , 左眼内吸取物 细胞涂片检查:见恶性肿瘤细胞,小圆细胞肿瘤
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- 克隆 基因 重排 淋巴瘤 诊断 中的 应用
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