chap15酶类药物.ppt
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1、第十五章 酶类药物,第一节 酶类药物的原料来源 一、原料选择 (1)不同酶的用料选择 乙酰化酶(鸽肝)、凝血酶(牛血)、透明质酸酶(羊睾丸)、溶菌酶(鸡蛋清),超氧化物歧化酶(血、肝) (2)注意不同生长发育情况及营养状况 (3)原料来源丰富 (4)从简化提纯步骤着手 (5)如用动物组织作原料,应在此动物宰杀后立即取材。,酶类药物,二、微生物酶制剂高产菌株的选育 菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。优良菌种不仅可以提高酶制剂产量和发酵原料的利用率,而且还与增加品种,缩短生产周期,改进发酵和提炼工艺条件等密切相关。优良菌种获得的三种途径: (1)从自然界分离筛选。 (2)用物理或化学的方法处理,
2、诱变。 (3)用基因重组与细胞融合技术。 三、微生物酶制剂生产的发酵技术 (一)培养基 1.碳源 (甘薯、玉米、麸皮、米糠) 2.氮源 (豆饼、花生饼、菜籽饼、硫酸铵、尿素) 3.无机盐 4.生长因子和产酶促进剂,(二)培养方法 1.固体培养法 固体培养法也称麸曲培养法,该法是利用麸皮或米糠为主要原料,另外视需要添加其它谷糠、豆饼等,加水拌成含水适度的半固态物料作为培养基。 2.液体培养法 液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁殖和产酶。根据通气方法的不同,又分为液体表面培养和液体深层培养。深层通气培养是目前应用最广的方法。 3.影响酶产生的一些因素 除培养基,发酵工艺参数对产酶的影响也十
3、分明显。 (1)温度 (2)pH (3)通气,(4)搅拌 (5)泡沫 发酵过程中,由于发酵液受到强烈的通气搅拌,培养基中某些成分的变化及代谢中产生气体,会形成较多的泡沫,而且气泡不易消失,是由于培养基中蛋白质分子排在气泡表面形成一层吸附膜,聚集成泡沫层之故。 消泡剂:天然油类,醇类,脂肪酸类,胺类,酰胺类,磷酸酯类,金属皂类,聚硅氧烷等。 (6)添加诱导剂和抑制剂 诱导酶 抑制剂(表面活性剂),第二节 酶类药物的提取和纯化 一、生物材料的预处理 (一)动物材料的预处理 1.机械处理 2.反复冻融 3.丙酮粉 组织经过丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉,不仅可以减少酶的变性,同时因细胞结构成分的破碎使得
4、蛋白质与脂质结合的某些化学键打开,促使某些结合酶释放到溶液中。 (二)微生物的预处理 要是胞外酶,则除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取酶。但对胞内酶则需要将菌体细胞破壁,制成无细胞的悬浮液后再行提取。,1.干燥法 (1)空气干燥 (2)真空干燥 (3)冷冻干燥 2.机械法 (1)研磨法 (2)组织匀浆法 (3)超声波法 (4)高压匀浆法 3.酶法处理,二、酶的提取 1.水溶液法 常用稀盐溶液或缓冲液提取。经过预处理的原料,包括组织糜,匀浆,细胞颗粒以及丙酮粉等,都可以用水溶液抽提。 许多酶再蒸馏水中不溶解,而在低盐浓度下易溶解,所以提取时加入少量盐可提高酶的溶解度。 2.有机溶剂法 某些结合酶
5、如微粒体和线粒体膜的酶,由于和脂质牢固结合,用水很难提取,为此必须除去结合的脂质,且不能使酶变性,最常用的有机溶剂是丁醇。丁醇具有以下特点: (1)亲脂性强,特别是亲磷脂的能力; (2)兼具亲水性,在0在水中的溶解度为10.5%;(3)在脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。 3.表面活性剂法,三、酶制剂的工业提取法 (一)发酵液的预处理及过滤 絮凝剂 (二)酶液的脱色 0.11.5%活性炭 (三)盐析法 (四)有机溶剂法 (五)喷雾干燥直接制备粉末酶制剂,四、酶的纯化 酶比活,总活力回收 (一)杂质的除去 酶提取液中,除所需酶外,还含有大量杂蛋白,多糖,脂类和核酸等,需要除去。 (1)pH和
6、加热沉淀法 利用蛋白质酸碱变性性质的差异可以通过调pH和等电点除去某些杂蛋白,也可以利用不同蛋白质对热稳定性的差异。(SOD酶) (2)蛋白质表面变性法 利用蛋白质表面变性性质的差别,也可以除去杂蛋白。 制备过氧化氢酶,加入氯仿除杂蛋白。 (3)选择性变性法 利用蛋白质稳定性的不同,除去杂蛋白。,(4)核酸沉淀剂法 在微生物制备酶时,常含有较多核酸,可用核酸酶降解,离心分离,用核酸沉淀剂如三甲基十六烷基溴化铵,硫酸链霉素等。 (5)将酶与底物结合,用加热法除去杂蛋白。近来发现,酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后,稳定性大大提高,这样可以用加热法除去杂蛋白。 (二)脱盐和浓缩 1.脱盐 (1)透析
7、 玻璃纸袋 (2)凝胶过滤 Sephadex G10,2浓缩 (1)冷冻干燥法 (2)离子交换法 (3)超滤法 (4)凝胶吸水 (三)酶的结晶 把酶提纯到一定纯度以后,可使其结晶。 蛋白质分子多数处于含水的环境中,蛋白质分子与水分子结晶形成稳定的水合物。当蛋白质的浓度非常高的时候,溶液中没有足够可以与蛋白质结合的水分子用于形成水合物,在蛋白质分子之间也没有足够的水分子可以将它们充分隔开,于是蛋白质就以无定形沉淀或结晶的形式从溶液中析出。 1.酶的结晶方法,(1)盐析法 在适当的pH、温度等条件下,保持酶的稳定性,慢慢改变盐浓度进行结晶。结晶时采用的盐有硫酸铵,柠檬酸钠,乙酸铵,硫酸镁等。利用硫
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