chp20 细胞生长.ppt
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1、第二十章 细胞生长调节因子与组织制剂,第一节 细胞生长调节因子的概述,一、细胞生长调节因子的概念 细胞生长调节因子系在体内和体外对效应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的一类物质。 细胞生长因子常称为生长因子,实际上应包括负性细胞生长因子,即细胞生长抑制因子,因此以细胞生长调节因子来表达广义的细胞生长因子。,二、细胞因子的共同特性 共同的特征 : 1、绝大多数细胞因子是低分子量(1530kD)的蛋白或糖蛋白。 2、细胞因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用。 3、一种细胞可产生多种细胞因子,不同类型的细胞也可产生一种或几种相同的细胞因子,三 细胞因子的分类和生物学活性 细胞因子的种类 细胞
2、因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子和趋化性细胞因子六类。 白细胞介素(IL)最初是指由白细胞产生又在白细胞间发挥作用的细胞因子,后来发现白细胞介素可由其他细胞产生,也可作用于其他细胞。,干扰素(IFN)是最先发现的细胞因子,因其具有干扰病毒感染和复制的能力故称干扰素。根据来源和理化性质,可将干扰素分为、和三种类型。IFN-主要由白细胞、成纤维细胞和病毒感染的组织细胞产生,也称为型干扰素。IFN-主要由活化T细胞和NK细胞产生,也称为型干扰素。 肿瘤坏死因子(TNF)一种能使肿瘤发生出血坏死的物质。肿瘤坏死因子分为TNF-和TNF-两种,前者主要由活化的单核-巨
3、噬细胞产生,抗原刺激的T细胞、活化的NK细胞和肥大细胞也分泌TNF-。TNF- 主要由活化的T细胞产生,又称淋巴毒素。,集落刺激因子(CSF)是指能够刺激多能造血干细胞和不同发育分化阶段的造血干细胞进行增殖分化,并在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。 生长因子(GF)是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。多种未以生长因子命名的细胞因子也具有刺激细胞生长的作用,从这个意义上讲,它们也是生长因子,如IL-2是T细胞的生长因子,TNF是成纤维细胞的生长因子。有些生长因子在一定条件下也可表现对免疫应答的抑制活性,如TGF可抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的成熟及巨噬细胞的激活。,趋化性细胞因子是一
4、个蛋白质家族,由十余种结构有较大同源性、分子量多为810kD的蛋白组成。 趋化性细胞因子主要由白细胞与造血微环境中的基质细胞分泌,可结合在内皮细胞的表面,具有对中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的趋化和激活活性。 淋巴细胞趋化蛋白,对淋巴细胞有趋化作用 。,二、细胞生长调节因子的一般制备方法与活性测定 ()一般制备方法 细胞生长调节因子以提取方法制备得量很低,主要是通过组织培养获得。 动物细胞培养 1、基本概念 体外培养就是将活的生物体结构成分或者活的微小个体放到体外环境中让共生存和生长的技术。 部分培养所培养的生物成分无外乎有两种结构形式,其一是小块组织或称为组织块,
5、其二是将生物组织分散后制成的单个细胞。 体外培养分为原代培养和继代培养两大类。,体外培养可分为植块培养法和分离(散)细胞培养法两大类方法。前者就是将植块直接进行培养,使之在体外条件下存活和生长;而后者就是将细胞悬液用于培养,使分散的细胞在体外条件下存活和生长。 体外培养的结果无外乎有两种,一是维持生存,一是发生显著增长。,动物细胞的结构较原核细胞复杂得多,而且已不是靠一个细胞包办一切生理活动,各种细胞都有明确的分工。为了适应其功能的需要,细胞的形态也有了相应的变化,我们称这种变化为分化(或称特化)。我们通常将离体培养的细胞分为两类:贴壁依赖型和贴壁非依赖型,前者可简称为贴壁细胞,后者可简称为悬
6、浮细胞。,2)生理特点 细胞的分裂周期长 细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的 动物细胞对周围环境十分敏感动物细胞对培养基的要求高,动物细胞培养基大致可以分成3类: 天然培养基 在细胞培养的早期阶段人们多采用该类材料做培养基,如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。 合成培养基 成分明确的化学试剂配制而成 。单纯采用这种合成培养基,细胞常常仍不能很好地增殖,甚至细胞都不能贴壁。因此在使用时常常需要加人一定量的动物血清,最常用的是添加510%的小牛血清。在杂交瘤细胞的培养中,血清的要求更高,常需用10%20的胎牛血清。,无血清培养基 动物细胞蛋白修
7、饰功能与细菌不同 动物细胞的蛋白质合成除了在游离的核糖体上进行外,还在与糙面内质网上结合的核糖体上进行。在游离核糖体上合成的蛋白质都用于细胞质基质内,而在与膜结合的核糖体上合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白,它们多数为糖蛋白。这些寡糖链,有的在内质网中加接,有的在高尔基体内加接。在内质网中加接的是N-链寡糖,在高尔基体内加接的是O-链寡糖,蛋白质的糖基化与细胞的许多生理功能密切相关,如细胞识别、表面受体、胞内消化和外排分泌物等。原核生物由于缺少糙面内质网结构,因此无法对蛋白质迸行糖基化和其他一系列翻译后修饰。 综观动物细胞的上述6点生理特点,不难想象,与采用原核细胞相比,采用动物细胞作为宿
8、主细胞生产药品,有它不足的一面,如培养条件要求高、成本贵,产量低等;但也有它优越的一面,即它们多半是分泌在胞外的,收集纯化方便;得到了较完善的翻译后修饰,特别是糖基化,因此更与天然的产品一致,更适于临床使用。,3、生产用动物细胞的要求 (1)、什么样的细胞允许用以生产人用的药品 。 正常组织分离的原代细胞 只要是二倍体细胞,二倍体细胞的寿命一般都不会超过50代。 取消了对传代细胞使用的限制 (2)、用于生产的动物细胞不外乎3类 原代细胞 原代细胞是直接取自动物组织、器官,经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。,二倍体细胞系 原代细胞经过传代、筛选、克隆,从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有
9、一定特征的细胞株。 转化细胞系 这类细胞是通过某个转化过程形成的,它常常由于染色体的断裂变成了异倍体,从而失去了正常细胞的特点,而获得了无限增殖的能力。 这种转化过程可以是自发的,即正常细胞在传代培养过程中,大部分细胞随着传代次数的增加,寿命逐渐终结,但其中有个别细胞可自发地转化而形成有无限生命力的细胞系。,此外,直接从动物的肿瘤组织中建立的细胞系也是转化的细胞。由于转化的细胞具有无限生命力,而且常常倍增时间较短,对培养条件和生长因子等要求较低,故更适于大规模工业化生产的需要,4、基因工程细胞的构建和筛选 尽管上述的原代细胞、二倍体细胞系和转化细胞系三者都已被用于生产中,但在生产中采用更多的、
10、更有前景的是融合细胞及采用基因工程手段构建的各种工程细胞。 (1)、真核细胞基因表达载体的构建 为了要将外源基因在动物细胞中高效表达,首先要将其构建在一个高效表达载体内。目前一般使用的载体有两类: 一类是病毒载体,如牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒和杆状病毒等。,另一类是质粒载体,而且常常是穿梭质粒载体,即在细菌和哺乳动物细胞两者体内都能扩增。 (2)、基因载体的导人和高效表达工程细胞株的筛选 载体构建后,如何导人动物细胞呢?目前的方法大致可分为4类 : 融合法 化学法 物理法 病毒法 细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法 重组逆转录病毒介导法 脂质体介导法 DEAE一葡聚糖法 显微注射法
11、重组洲A病毒介导法 原生质融合法 染色体介导法 基因枪法 多瘤病毒样颗粒介导法 微细胞介导法 鬼影红细胞介导法,外源基因导入动物细胞的效率是很低的,依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统 ,从上百万个细胞中筛选出已整合并表达外源基因的工程细胞 。 FDA的规定,用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库:原始细胞库和生产用细胞库。,5、动物细胞的培养条件 (1)所有的与细胞接触的设备、器材和溶液,都必须保持绝对无菌,避免细胞外微生物的污染。 (2)必须有足够的营养供应,绝对不可有有害的物质,避免即使是极微量的有害离子的掺入。 (3)保证有适量的氧气供应。 (4)需随时清除细胞代谢中产生的有害产物
12、。 (5)有良好的适于生存的外界环境,包括pH、渗透压和离子浓度等。 (6)及时分种,保持合适的细胞密度。,6、动物细胞大规模培养的方法 动物细胞培养的方法,一般可根据培养细胞的种类分为原代细胞培养和传代细胞培养。 又可根据培养基的不同分为液体培养和固体培养。 还可根据培养容器和方式的不同分为静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养等。 但从生产实际看,动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。,1、悬浮培养 所谓悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。 2、贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。它适用于一切贴附
13、依赖性细胞(贝占壁细胞),也适用于兼性贴壁细胞。该方法的优缺点与悬浮培养正好相反,优点是适用的细胞种类广(因为生产中所使用的细胞绝大多数是贴壁细胞),较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度 。 3、贴壁一悬浮培养,或称假悬浮培养 (1)微载体培养 (2)包埋和微囊培养,动物细胞生物反应器 1、搅拌罐式生物反应器 2、气升式生物反应器 3、中空纤维式生物反应器 4、透析袋或膜式生物反应器 5、固定床或流化床生物反应器,植物组织和细胞培养是指在无菌和人工控制的营养(培养基)及环境条件(光照、温度等)下,研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。,植 物 细 胞 培 养,一、基本概念,1
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