HPLC和CE衍生试剂.ppt
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1、液相色谱和毛细管电泳中的 衍生试剂,为什么衍生 衍生方式 衍生试剂的构成与要求 衍生试剂 种类及应用,液相色谱和毛细管电泳中的衍生试剂,为什么衍生,检测方法与检测信号 化学衍生主要是用于改善检测灵敏度 不好线性检测或较窄线性范围检测和高检出限的分析物,通过衍生得到改善 不能与其它基体物质分辨的分析物,通过衍生可以扩大差别 荧光生成(fluorogenic)试剂和荧光标记(fluorescent label)试剂.,衍生反应方式,柱前衍生(pre-column derivatizations) 柱后衍生(post- column derivatizations) 柱中衍生 (on column
2、derivatizations) 离线(off line)柱前衍生 在线(on line)柱前衍生, 离线(off line)柱后衍生 在线柱后衍生,柱前衍生,自由性大 衍生与柱分离的流动相无关 提高检测灵敏度 改善分离方法选择性和色谱分辨率 易于优化反应条件 衍生物稳定 产率高 副反应产物少 选择易与色谱流动相混合的溶剂作为衍生溶剂,在线柱后衍生,柱后反应器 衍生反应不强调生成单一的稳定的衍生产物 过量的衍生试剂干扰检测 要求快速并允许现时检测 加泵供给衍生试剂 反应溶剂必须与分离用的流动相易混溶 衍生试剂与柱淋洗液有效混合,柱中衍生,这一衍生方法基本是把衍生试剂溶入流动相,注射样品后,在柱
3、上分析物与流动相中的衍生试剂反应 方法适于不太稳定的衍生物,反应要快 所需衍生试剂量较大,昂贵的衍生试剂不应采用此法.,衍生试剂的构成与要求,衍生试剂必须含有可检测的基团,即显色团(chromophore)、荧光团(fluorophore)和电基团(electrophore) 含有反应基团如FITC,衍生试剂稳定 要纯,不含杂质, 形成一种衍生物,尽可能没有副产物形成 尽可能高衍生物产率; 需衍生试剂尽少,避免试剂峰的干扰. 对于柱后衍生试剂,同样须具有的共同条件外,应:(1)试剂与被分析物反应迅速;(2)衍生试剂转化率高,过量少,以免干扰衍生物的检测.,进展文献,邓樱花,王红,张华山,高效液
4、相色谱和毛细管电泳分离荧光检测小分子氨基生物物质的进展 ,分析科学学报,2010,26(1):103,衍生试剂 种类与应用,胺的衍生试剂 巯基的衍生试剂 羟基的衍生试剂 羰基化合物的衍生试剂 羧酸的衍生试剂 分离对映体的手性衍生试剂,被衍生的氨基化合物,氨基酸 神经递质氨基酸 谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)、-丙氨酸(-Ala)、牛磺酸(Tau)等 神经递质 多巴胺、肾上腺素、去甲基肾上腺素 小肽和肽段 二甘肽,三甘肽,谷胱甘肽,脑啡肽等 磷酸化氨基酸 磷酸化丝氨酸(P-Ser)、磷酸化苏氨酸(P-Thr)和磷酸化酪氨酸 脂肪胺 生物胺 腐胺、尸
5、胺、精胺、亚精胺 蛋白质,胺的衍生试剂,芳香邻二醛类 异硫氰酸酯类 酰氯类 羰酰氯类 磺酰氯 活性卤类 N-羟基琥珀酰亚胺活性酯类 其它,芳香邻二醛类,OPA、2,3-萘二醛(NDA)、3-(2-呋喃甲酰基)-喹啉-2-羰醛(FQCA)、3-(4-羧基苯甲酰基)-喹啉-2-羰醛(CBQCA).,Fig.1-2. Typical electropherogram of a 500 nL aliquot of derivatized microdialysate from the rat striatum. The separation buffer was 75 mM borate buffer
6、 (pH 9.2) containing 70 mM SDS and 10 mM HP-CD. IS was cysteic acid.,He-Cd 激光器,Electrophoresis 2003, 24, 31873196,2, 3-萘二醛(NDA)衍生CE-LIF分离检测活体中的GABA、Glu、L-Asp,检测限: 0.6-3 nM,.异硫氰酸酯类,苯异硫氰酸酯(PITC),PITC PTC-氨基酸 PTH氨基酸,Edman试剂 紫外检测 254nm 衍生物稳定,分析时间也较短 副产物、溶剂等多种干扰因素可通过高效蒸发除去,较烦琐 30min内分离20余种氨基酸,4-N,N-对二甲胺基
7、偶氮苯-4-异硫氰酸酯(DABITC ),4-(5,6-二甲氧基苯并噻唑)苯异硫氰酸酯,荧光素异硫氰酸酯(FITC),J. Chromatogr. B, 2001, 758, 277-282,Fig. 1-1. Electropherogram of standard amino acids (each amino acids concentration: 2.510-8 M). (1)Arg, (2) Lys, (3) Gln (4) GABA, (5)Ala, (6) Gly, (7) Glu, (8) Asp, (a) FITC, (b) decomposition products o
8、f FITC.,下丘脑的神经递质氨基酸在运动中枢神经中起着重要作用,荧光素异硫氰酸酯(FITC)衍生CE-LIF分离测定大鼠下丘脑中的八种氨基酸,衍生条件:pH 10 硼砂缓冲溶液, 室温, 避光17 h,Fig. 1-3. Typical chromatogram of SIFA derivatives with amines.Mobile phase: methanolwater (46/54, v/v) solution containing10 mmol/L pH 5.40 citric acidNa2HPO4 buffer; amine concentration: 0.1 mmol
9、/L; fluorescence detection wavelengths: ex/em = 488/516 nm. (1) Methylamine (2) ethylamine (3) ethylene diamine (4) FOAA (hydrolyzed product of SIFA) (5) isopropylamine (6) isobutylamine (7) n-butylamine (8)1,4-butylene diamine (9) 1,5-amylene diamine. Reprinted from ref.197 ,酰氯类,磺酰氯类(-SO2Cl) 和羰酰氯(-
10、COCl),丹磺酰氯 DNS-Cl.,5-二甲氨基-1-萘磺酰氯,熔点69-71oC 激发波长350nm,发射波长530nm. 衍生反应所30min到2h 非水溶液衍生时间较短 衍生物产率受介质pH值和水的含量影响 稳定12-24h,对紫外光比较敏感,衍生反应须避光进行,衍生物要避光存放. 测定了22种氨基酸并用于人体血浆样品,检测限1.0pmol 紫外检测,灵敏度低,检出限仅50-100pmol.,ODS柱(1254.6mm,3m);流动相:A,3%四氢呋喃的15mmol/L磷酸钠缓冲 溶液(pH6.3);B,60%乙晴的15mmol/L磷酸钠缓冲溶液(pH6.3);梯度淋洗; 柱温,25o
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