NMR方法解析蛋白质结构.ppt
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1、NMR方法解析 蛋白质结构,冯银刚 北京核磁共振中心 (http:/) 北京大学化学与分子工程学院 ,2006.4.12,蛋白质结构层次,氨基酸通过肽键形成的生物高分子 一级结构、二级结构、三级结构、四级结构,肽键具有双键性质而不能任意旋转 主链可旋转的二面角,,20种常见的氨基酸残基 通常NMR中一个自旋系统是指一个氨基酸残基上的所有原子,核磁共振方法解析蛋白质溶液结构,测定原子(氢原子)之间的距离信息和其他约束信息,得到空间结构模型 化学结构(氨基酸序列,即一级结构)已知,测定空间结构(三级结构,四级结构),适用范围分子量,分子量受限:谱峰重叠,分子增大造成横向弛豫时间减少(线宽增加)
2、同核二维1H谱:80氨基酸 异核多维(二维、三维): 常规三共振(1H,15N,13C) 200氨基酸 氘标记,特殊标记 已报道有700氨基酸 同核样品可以是天然提取、化学合成或分子生物学方法培养制备 标记样品通常只能通过分子生物学方法培养制备,常规样品,浓度:毫摩尔每升 500uL 10kDa 5毫克每样品 均一 没有聚合 水溶液(10%重水锁场) pH7.5 常用缓冲体系:Tris-HCl, 磷酸盐,醋酸盐 稳定性:室温下大于一周 NaN3 蛋白酶抑制剂,蛋白质的一维谱,同核方法,指认方法不同:2D 1H-1H 两种样品:H2O, D2O 实验 TOCSY, COSY, NOESY 自旋系
3、统指认,序列指认 指纹区:HN-HA 每个残基一个峰,同核方法指认,基于相邻序列间的NOE,三共振方法 以杨树谷氧还蛋白C1为例,实验之前蛋白质基本性质,杨树谷氧还蛋白C1 (Grx-C1) 分子量:117个氨基酸残基,12.5kDa 等电点:8.49 同源性:35% 功能:谷胱甘肽依赖的氧化还原酶 稳定、无聚合,MASKQELDAALKKAKELASSAPVVVFSKTYCGYCNRVKQLLTQVGASYKVVELDELSDGSQLQSALAHWTGRGTVPNVFIGGKQIGGCDTVVEKHQRNELLPLLQDAAATAKNPAQL,样品制备分子生物学方法,基因克隆:cDNA质粒载
4、体 蛋白质表达纯化 大肠杆菌E. coli BL21(DE3) 离子交换色谱,凝胶过滤 纯度:SDS-PAGE 电泳上为单一条带 同位素标记 使用M9培养基:无机盐,葡萄糖 15N NH4Cl, 13C 葡萄糖 样品 1mM 蛋白质 磷酸钾缓冲液,pH6.4 , 90%H2O/10%D2O 0.01% DSS (化学位移校准) 40mM DTT,0.01% NaN3,蛋白酶抑制剂,数据采集,谱仪 Bruker 500MHz, 600MHz 三共振探头 采集用于解析一个蛋白质所需要的全部谱图时间约12月,数据处理,处理的内容: 线性预测加窗函数充零傅立叶变换相位校正基线校正 在线与离线处理 二维
5、谱:每个约几兆 三维谱:每个几十兆到几百兆 nmrPipe 多维谱的处理:每一维都要分别进行傅立叶变换,化学位移校准,重要性 1H使用 DSS (2,2-dimethylsilapentane-5-sulfonic acid sodium salt) 异核:间接校准 以DSS的0 ppm处的频率乘以换算因子得到异核的0 ppm的频率,NMR初步鉴定,蛋白质折叠程度,H2O,DSS,DTT,NMR初步鉴定,1H-15N HSQC 分散程度:折叠程度 确定谱宽 指认基础:每个氨基酸(除脯氨酸外)都在HSQC上有一个峰,三维实验(双共振、三共振),减少谱峰堆积 利用异核之间较大的耦合常数 基于J耦合
6、进行共振指认,减少对空间构象的依赖,三维实验,绝大多数异核多维实验可以类比于二维COSY, TOCSY, NOESY及其组合 主链指认实验 侧链指认实验 NOE实验,1 2 3 HN-NH-Ca(i,i-1),HN,Ca,NH,化学位移指认,化学位移:每个原子的身份证 主链指认 序列连接 氨基酸类型判断,主链指认,HNCACB-CBCA(CO)NH,化学位移指认,侧链指认 3D TOCSY或 COSY H(C)CH-TOCSY 芳环 (HB)CB(CGCD)HD (HB)CB(CGCDCE)HE 通过NOE确认指认 主链 侧链,用于Grx-C1指认的实验,主链指认:2D 1H-15N HSQC
7、, 3D HNCA, HNCACB, CBCA(CO)NH, HNCO, HN(CA)CO 10天 侧链指认:2D 1H-13C HSQC, 3D HBHA(CBCA)(CO)NH, (H)C(CO)NH, H(C)(CO)NH, 1H-15N TOCSY-HSQC HCCH-TOCSY, CCH-TOCSY, HCCH-COSY, CCH-COSY, 2D (HB)CB(CGCD)HD, (HB)CB(CGCDCE)HE 20天 NOE:3D 15N NOESY-HSQC, 13C NOESY-HSQC(for aliphatic region), 13C NOESY-HSQC(for ar
8、omatic region) 10天,Grx-C1指认结果,1H,15N,13C指认率:98% 1H-15N HSQC 上所有谱峰得到了指认 J. Biomol. NMR 2005, 31:263-264 BMRB 6410 http:/www.bmrb.wisc.edu,由化学位移得到二级结构的信息,二级结构 CSI:化学位移与无规卷曲的多肽化学位移之差 TALOS:基于数据库比对预测二面角 可用于结构计算和分析,结构计算,基本方法 由实验得到各种构象约束信息:距离,二面角 约束信息是不完备的 约束信息是不精确的 计算满足这些约束条件的构象 距离几何(Distance Geometry) 约
9、束条件下的分子动力学模拟(Restrained Molecular Dynamics Simulation),约束信息,距离约束 1H-1H NOE 氢键 二面角约束 主链 侧链 肽键:反式顺式 其他 手性 L-氨基酸,约束生成,NOE 指认 Unique:只有一种可能 Ambiguous:有多种可能 转化为距离 实验通常可检测 5 距离是不精确的:距离范围 距离是大量的精确结构,其中一种可能是正确的 多种可能都是正确的(谱峰重叠),二面角约束,a-helix: f = -100 to -20, y = -70 to -10 b-sheet: f = -180 to -60, y = 20 t
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- NMR 方法 解析 蛋白质 结构
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