八__肝糖原的提取、鉴定与定量.ppt
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1、肝糖原的提取、鉴定与定量肝糖原的提取、鉴定与定量 实验目的 1. 1. 掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。 2. 2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定 糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。 3. 3. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 4. 4. 熟练运用溶液混匀的各种方法(视具体情况,采用合熟练运用溶液混匀的各种方法(视具体情况,采用合 适的混匀方法)。适的混匀方法)。 5. 5. 正确掌握溶液
2、转移的操作。正确掌握溶液转移的操作。 6. 6. 正确操作使用分光光度计。正确操作使用分光光度计。 实验原理 (一)肝糖原的提取、鉴定(一)肝糖原的提取、鉴定 糖原储存于细胞内,采用研磨匀浆等方法可使细胞糖原储存于细胞内,采用研磨匀浆等方法可使细胞 破碎,低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织破碎,低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织 中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中 ,从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不,从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不 溶于乙醇而溶于热水,故先用溶于乙醇而溶于热水,故先用95
3、95乙醇将滤液中糖原沉乙醇将滤液中糖原沉 淀,再溶于热水中。淀,再溶于热水中。 实验原理 (二)肝糖原的鉴定(二)肝糖原的鉴定 糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中 葡萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后葡萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后 呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应 和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的存在。和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的存在。 CuSOCuSO 4 4 +2NaOH Na+2NaOH Na 2 2 SO SO
4、4 4 +Cu(OH)+Cu(OH) 2 2 2Cu(OH) 2Cu(OH) 2 2 + C+ C 6 6H H 1212O O 6 6 2CuOH+ 2CuOH+氧化型葡萄糖氧化型葡萄糖+H+H 2 2 OO 2CuOH Cu 2CuOH Cu 2 2 O(O(红色红色)+H)+H 2 2 OO Cu(OH) Cu(OH) 2 2 CuOCuO(黑色黑色)+H)+H 2 2 OO (三)肝糖原的定量(三)肝糖原的定量 糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖 进一步脱水生成糠醛衍生物进一步脱水生成糠醛衍生物5-5-羟甲基呋喃甲醛,此化合羟甲
5、基呋喃甲醛,此化合 物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm620nm 处有最大吸收。糖含量在处有最大吸收。糖含量在(10100)mg(10100)mg范围内,溶液颜色范围内,溶液颜色 的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的 已知葡萄糖含量标准溶液比色,通过标准对照法(直接比已知葡萄糖含量标准溶液比色,通过标准对照法(直接比 较法)即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中较法)即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中 非常稳定,故在显色之前,肝组织先置于浓碱中加热,以
6、非常稳定,故在显色之前,肝组织先置于浓碱中加热,以 破坏其它成分,而保留肝糖原。破坏其它成分,而保留肝糖原。 实验原理 实验材料 (一)仪器(一)仪器 1. 1. 普通离心机,室温普通离心机,室温100100恒温水浴箱(恒温水浴箱(22),),722722型分光光度计,精型分光光度计,精 度为度为10mg10mg级电子天平(级电子天平(11) 2. 2. 剪刀(剪刀(11),镊子(),镊子(11),研钵(),研钵(11) 3. 3. 试管架(试管架(11),),10mL10mL离心管(离心管(22),(),(1001510015)mmmm试管(试管(66) 4. 4. 刻度吸量管(刻度吸量管(
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- _ 肝糖 提取 鉴定 定量
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