蛋白质分子基础蛋白质制备.ppt
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1、蛋白质分子基础,第二章: 蛋白质的制备,本章主要内容,1.蛋白质分离纯化的一般程序 2.蛋白质的粗分离 材料的选择和细胞抽提液的制备 蛋白质的浓缩和脱盐 沉淀法分级蛋白质 3.蛋白质的层析分离 原理,离子交换、凝胶过滤、亲和层析等 4.蛋白质的电泳分析 原理、类型、聚丙烯酰胺电泳等,本章主要内容,5.蛋白质的结晶 原理、条件、方法 6.提纯过程中的定量 双缩脲法、福林试剂法、紫外吸收法、考马斯亮蓝染色法 7.蛋白质的纯度标准 电泳法、免疫化学法等 8.蛋白质的大规模分离纯化 蛋白质来源及释放、分离和浓缩、大规模层析与电泳。,第一节 蛋白质分离纯化的一般程序,1.生物组织的机械破碎:研磨法、超声
2、波法、冻融法和酶解法等(细胞外分泌物无需破碎)。 2.根据蛋白质的特性,选择不同的溶剂进行抽提。 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提, 酸性蛋白用稀碱性溶液抽提, 脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 3.离心:去亚细胞颗粒、细胞碎片等 4.粗提: 离心除去固体杂质后,可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理,得到蛋白质粗制品。 5.精制:可用层析法、电泳法等进行精制。 6.结晶:取得蛋白质晶体并测定蛋白质的性质。,蛋白质分离的注意事项,要建立一个方便灵敏的分析方法。 要选择一种最好的含有目的蛋白质的材料 分离步骤要尽可能少 尽量避免蛋白质在提纯中的变性。 低温(40C)、蛋白质酶抑制剂 巯基试剂(二硫苏糖醇)
3、可防止半胱氨酸的氧化。 金属螯合剂(EDTA等)可防止重金属离子对酶的失活作用。,第二节 蛋白质的粗分离,材料的选择和细胞抽提液的制备 蛋白质的浓缩和脱盐 沉淀法分级蛋白质,(一)材料的选择,材料选择的原则 目的蛋白质的含量要高 容易获得 不同种属和个体会有差别 动物:性别、年龄、季节、生理条件不同,蛋白质在质和量上会有区别 植物:不同组织、器官、不同发育阶段、有外来病理侵袭时各不相同。 注意:取材后立即使用或置-10-50保存备用。,二、细胞破碎方法及细胞提取液的制备,破碎细胞的方法,温和方法 较剧烈方法 剧烈的方法,温和方法,细胞溶解 红细胞,渗透压破碎细胞膜 酶降解 溶菌酶处理细菌,消化
4、细胞壁 化学溶解/自溶 甲苯抽提酵母,部分溶解细胞壁 手动匀浆器 肝组织,迫使细胞通过窄隙撕开细胞膜 研磨 肌肉等,研磨产生的切割力破坏细胞,较剧烈方法,韦林氏捣切器(waring型) 大多数动物组织和植物组织 切削作用和剪切力 磨料研磨(砂、氧化铝) 植物组织与细菌,微小粗糙表面破坏细胞壁,剧烈方法,压榨机(french press) 迫使细胞在高压下通过小孔,剪切力破坏细胞 细菌和植物细胞 超声作用 剪切力和空化作用破碎细胞 细胞悬浮液 震动玻璃球(直径0.51 mm) 与玻璃珠一起快速震动,撕开细胞壁 细胞悬浮液 研磨机 迫使细胞在高压下通过小孔,剪切力破坏细胞,大规模操作。 作用于悬浮
5、液,抽提缓冲液的提取,尽量使用类似于生理条件下的缓冲液,常用的缓冲液有: 2050 mmol/L的磷酸缓冲液,pH7.07.5; 0.1 mol/L Tris-HCl ,pH 7.5; 缓冲液中可加入EDTA(15 mmol/L)或者蛋白质稳定剂等。,其他注意事项,动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪。 制备植物细胞时,在缓冲液中加入聚乙烯吡咯啉酮(PVP)可以减少褐变, 它可以吸附多酚化合物。 革兰氏阳性菌可用溶菌酶消化,370C处理15分钟即可溶解细胞壁。 革兰氏阴性菌较难消化。可先用非离子去污剂(如Triton X-100)、巯基乙醇或甘油处理细胞。在溶液中还可加入脱氧核糖核酸酶I(
6、10 ug/mL),可以使溶液的黏度降低,可以提高抽提液的质量。,三、膜蛋白的释放,膜蛋白存在于细胞膜或各种细胞器当中(叶绿 体、线粒体、内质网、或细胞核) 外周蛋白 通过静电力或共价键和外膜脂质的极性头部螯合在一起。 占膜蛋白的2030% 内在蛋白(固有蛋白) 嵌合在膜脂双层结构中。 大部分膜蛋白是固有蛋白,生物膜的功能,生物膜研究的意义,外周蛋白,外周蛋白的分离,改变离子强度 金属螯合剂(EDTA)可将其抽提出来,膜内在蛋白的提取,提取的原则 抽提膜蛋白时,首先削弱膜蛋白和膜脂的疏水结合,同时保持疏水基暴露在外的天然状态。此过程叫做增溶作用。 常用的增溶剂是去污剂,它可以使膜蛋白疏水部分与
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