氨基酸分析-2-27.ppt
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1、1,第二章 氨基酸分析,2,氨基酸分析在蛋白质化学和生物技术研究、临床诊断和细胞生理学研究、营养学与卫生保健、培育农作物优良品种、食品、制药等领域具有非常重要的意义。,氨基酸分析,3,氨基酸的基本结构及性质,氨基酸是分子中含有氨基和羧基的一类化合物。 组成蛋白质的氨基酸只有二十种。其中有八种为人体必需氨基酸。 人体必需的氨基酸:人体内不能合成,只有靠食物供给的氨基酸。 各种蛋白质含氨基酸的种类和数量都各不相同。,4,氨基酸的分类,1、根据氨基酸的酸碱性,5,酸性氨基酸,二个羧基 一个氨基,天冬氨酸 谷氨酸,碱性氨基酸,一个羧基 二个或二个以上氨基,赖氨酸 精氨酸 组氨酸,中性氨基酸,一个羧基
2、一个氨基,实际水溶液呈弱酸性: 电离能力 COOH NH2,6,2、根据氨基酸的化学特性,疏水性:Ala(丙氨酸) Val(缬氨酸) Leu (亮氨酸)Ile(异亮氨酸) Phe(苯丙氨酸) Pro(脯氨酸) Met(蛋氨酸) 带电:Arg (精氨酸)Lys(赖氨酸) Asp (天冬氨酸)Glu (谷氨酸)(His)组氨酸 极性: Tyr(酪氨酸) Trp(色氨酸)Ser(丝氨酸)Cys(半胱氨酸)Thr(苏氨酸)Asn(天冬酰胺)Gln (谷氨酰胺)His(组氨酸)特殊:Gly (Pro)甘氨酸 脯氨酸,氨基酸的分类,7,带电氨基酸,8,极性氨基酸,9,氨基酸的立体化学,由蛋白质水解的氨基酸
3、都为-氨基酸,除甘氨酸外,所有- C都为手性碳原子。 天然的氨基酸均为L-氨基酸,10,氨基酸的理化性质,1. 溶解度 2. 熔点:高 3. 旋光性有旋光性 4. 味感:D-氨基酸大多带甜味,L-氨基酸有苦、甜、鲜、酸等四种不同味感。,1. 两性性质:氨基酸分子中含有氨基及羧基,使其既能象酸又能象碱一样解离; 2. 与甲醛作用: 3. 与2,4-二硝基氟苯作用: 4. 与茚三酮的作用: 5. 与异硫酸苯酯的作用: 6. 与荧光胺的作用: 7. 与5,5-双硫基-双(硝基苯甲酸)反应,11,等电点,概念:将氨基酸水溶液的酸碱度加以适当地调节,使氨基酸的酸性电离程度与碱性电离程度相等。此时,氨基酸
4、带有的正电荷数目和负电荷数目相等,此溶液的pH值称为氨基酸的等电点,用 pI 表示。 在等电点时,氨基酸的溶解度最小,易沉淀 等电点可用酸碱滴定方法测定,也可通过pK值计算 侧链无解离基团时:pI=(pK1+pK2)/2 侧链有解离基团时, pI相当于氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK值和的一半,12,pH = pI,净电荷为零,在电场中不移动,pH pI,带正电荷,在电场中移向负极,在电场中移向正极,pH pI,带负电荷,等电点,要使氨基酸达到等电状态: 中性氨基酸: pI pH 7 加碱,13,与茚三酮的显色反应,水合茚三酮,CO2,14,蓝紫色化合物,根据CO2的量或蓝紫色的深浅程度 作
5、为-氨基酸定量分析的依据。,与茚三酮的显色反应,15,氨基酸的定量斑点分析, 大多数氨基酸不含有特征发色基团。因此,氨基酸的分析依赖于衍生化 反应。 对衍生化试剂的要求是反应快,并且 产物与试剂本身的光谱性质有明显的差异。 常用的衍生化试剂有2,4-二硝基氟 苯、荧光胺及邻苯二甲醛等。 根据产物性质的不同,衍生化试剂可分为显色剂及荧光衍生化试剂两大类。,16,斑点显色分析法, 茚三酮是氨基酸的斑点显色分析中非常简单的衍生化试剂。 它可以与一级和二级胺在酸性介质中pH(34)加热反应,反应产生氨、二氧化碳和蓝-紫色的络合物。一级和二级胺的检测波长分别为570和440nm。若二者同时存在,一般在5
6、00 nm处测定,灵敏度有所降低。,17,另一种常用的显色反应试剂是2,4-二硝基氟苯,它可以与样品中氨基酸及一级和二级胺反应,生成黄色络合物,检测波长在420nm。该法测定的是氨基酸的总量。,斑点显色分析法,18,斑点荧光分析法,荧光胺是用于氨基酸分析的高灵敏荧光衍 生化试剂,可用于氨基酸的表面分析,如 薄层色谱。 邻苯二甲醛(OPA)是用于氨基酸荧光分 析的另一种常见的衍生化试剂。,19,色谱方法,离子交换色谱法 反相色谱分析法 柱前衍生气相色谱法 衍生化毛细管电泳法,20,离子交换色谱法,离子交换色谱的基本原理是基于带电荷的阴阳离 子与带相反电荷的离子交换基团的相互作用。 氨基酸、肽和蛋
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