氨基酸发酵工艺学.ppt
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1、第三章 氨基酸发酵工艺学,学习氨基酸发酵工艺学的目的、研究对象、任务及内容,氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵,由发酵所生成的产物氨基酸,都是微生物的中间代谢产物,它的积累是建立在对微生物正常代谢的抑制。在脱氧核糖核酸(DNA)的分子水平上改变、控制微生物的代谢,使有用产物大量生成、积累。 以探讨氨基酸发酵工厂的生产技术为主要目的。氨基酸的生产以发酵为主,发酵过程的控制是整个生产的关键,产物的提纯及设备选用当否,也会影响产物得率。氨基酸发酵工艺学研究的对象应该包括从投入原料到最终获得产品的整个过程,其中有微生物生化问题、生化工程问题,也有分析与设备问题。 今后的发展是采用诱变、细胞工程、基因工程的
2、手段选育出从遗传角度解除了反馈调节和遗传性稳定的更理想菌种,提高产酸;采用过程控制,优化工艺进行连续、自动化生产获得稳产高产;探求新工艺、新设备,以提高产率;研究发酵机制问题,以便能更好地控制氨基酸微生物中间代谢产物的发酵。,绪 论,第一节、氨基酸概论,1、氨基酸简介 构成蛋白质的基本分子单元。 碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基和氨基及侧链。侧链不同,氨基酸的性质不同。 目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。,2、氨基酸的用途,(1)食品工业: 强化食品:赖氨酸,苏氨酸,色氨酸于小麦中 增鲜剂:谷氨酸单钠和天冬氨酸 苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此
3、产品1981年获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。,(2)饲料工业: 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料 ,添加蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸等必须氨基酸可促进动物生长发育、改善肉质、节省蛋白饲料、降低成本等。 (3 )医药工业: 多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调 氨基酸注射液由1985年的100万瓶增长到2003的1.5万瓶,每年以15-20%的速度递增,全行业的年产值预计能达到10亿元 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。 (4)化学工业: 谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙氨酸纤维(合成高分子化合物)。能保持皮肤湿润的润肤剂焦谷氨酸钠和质量接近
4、天然皮革的聚谷氨酸人造革,以及人造纤维和涂料。,表3-8 世界氨基酸主要生产厂家生产能力,3、氨基酸的生产方法,发酵法: 直接发酵法:野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型回复突变株发酵。包括添加前体发酵法:如用邻氨基苯甲酸,生产L-色氨酸;甘氨酸生产L-丝氨酸。 酶法:利用微生物细胞或产生的酶来制造氨基酸。延胡索酸和铵盐为原料,经天冬氨酸酶催化生产L-天冬氨酸。 提取法:常用毛发、血粉等蛋白质原料水解,从中提取。如胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 合成法:合成法获得DL-蛋氨酸、不对称合成法获得L-氨基酸。如丙氨酸、甘
5、氨酸、苯丙氨酸。 传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目的。,第二节、氨基酸发酵菌株的育种,是氨基酸代谢控制发酵的基本策略之一,发酵工程要求微生物大量地合成特定的代谢产物,这一目的只有当微生物的部分代谢调控机制遭到破坏时才能达到。用人工诱变的方法有目的地改变微生物固有的调节机制,使合成产物的途径畅通无阻,最大限度地积累特定产物,这种发酵称为代谢控制发酵。,1、 用野生菌株的方法,分离的野生菌株具备积累产物的特性,可用于直接发酵(产率低)。如谷氨酸发酵。 通过转换发酵,可延伸获得其它产物。主要采用改变培养条件。如谷氨酸发酵中改变铵离子浓度、磷酸浓度,使
6、谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氨酸发酵。,2. 用营养缺陷变异株的方法,通过诱变出菌体内氨基酸生物合成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体,使生物合成在中途停止,不让最终产物起调控作用。 如用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵,谷氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵,异亮氨酸缺陷菌株的脯氨酸发酵。,谷氨酸棒状杆菌的苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的合成是与分枝途径相联系的(图4-8),筛选高丝氨酸营养缺陷型后,限量供给苏氨酸时,就能解除由苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制作用,而获得赖氨酸的过量生产。这是因为仅有赖氨酸或苏氨酸存在时,天冬氨酸激酶不被抑制,只有两者的协同效应才能造成抑制。在限量供给苏氨酸的情况下,即使赖氨酸过剩,抑制
7、作用也很难发生。,3. 类似物抗性变异株的方法,用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化合物加入培养基内,使其发生控制作用,从而抑制微生物的生长。这样,就可以得到在这种培养基中能够生长的变异株,而这种变异株正是解除了调控机制的,能够生成过量的氨基酸。 利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。,高丝氨酸脱氢酶,例如,在黄色短杆菌的赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸生物合成中(图5-16所示),选育抗苏氨酸结构类似物2-氨基-3-羟基戊酸(AHVr)突变株,得到了具有反馈抑制抗性,高丝氨酸脱氢酶活性提高1300倍,能积累14g/L苏氨酸的突变株。,4. 体内及体外基因重组的方法,基因工
8、程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外基因重组方法。 体内基因重组在应用上又称为杂交育种,主要方法包括:转化、转染、接合转移、转导和细胞融合等,这都是在细胞内暂时地产生染色体的局部二倍体,在两条DNA链之间引起两次以上的交叉,是遗传性重组现象。 细胞内基因重组技术的缺点是,现在只在同种或有近缘关系的微生物之间进行并较难成功。,代谢工程 在阐明代谢途径及其调控规律的基础上,应用重组DNA技术可以改变代谢途径分支点上的流量或引入新的代谢步骤与构建新的代谢网络。 其主要步骤为: 鉴定目标代谢途径涉及的酶(特别是限速酶); 取得酶基因,必要时可用蛋白质工程技术,如定点诱变,基因剪接等,使蛋白具有新的特
9、点(增强活性或稳定性、解除反馈抑制等); 将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节元件一起克隆进目标生物; 使调节元件的作用及培育条件最优化。,5、基因工程菌,通过基因工程技术,构建理想的工程菌株,5.1载体-受体系统及克隆表达的研究,受体的获得 目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌K-12及棒状杆菌家族,通常是通过诱变选育出的基础产率较高的菌株。 大肠杆菌遗传背景研究得清楚,载体系统完善,利于工程菌的构建,但它含有内毒素且不能将蛋白产物分泌至胞外,为应用带来困难。 棒状杆菌能克服这两个缺点,但载体受体系统研究较晚且有限制修饰系统的障碍,所以获得利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体菌是
10、尚待解决的问题。,5.2 载体的构建,有效的载体需要有在受体菌中可启动的复制起始位点,这可从棒状杆菌家族内源小质粒中获得; 载体所需的筛选标记及外源基因插入的多克隆位点,可从常用的克隆载体中获得。,5.3 基因转移手段,通常采用的方法有:原生质体转化、转导,电转化,接合转移。 原生质体转化的方法是较早采用的方法,由于受到原生质体再生条件的局限,效率不高; 电转化方法由于高效,快速被广泛使用,目前它的转化效率可达到原生质体转化法的100-1000倍。 接合转移可用于基因在亲缘关系远的物种之间的转移,并且可将外源基因整合于染色体上,易于稳定遗传。,第三节 氨基酸发酵的代谢控制,控制发酵的条件 控制
11、细胞渗透性 控制旁路代谢 降低反馈作用物的浓度 消除终产物的反馈抑制与阻遏作用 促进ATP的积累,以利氨基酸的生物合成,一、菌种的代谢调控,是氨基酸代谢控制发酵的基本策略之二,1、控制发酵环境条件,专性需氧菌,控制环境条件可改变代谢途径和产物。,2、控制细胞渗透性,生物素、油酸和表面活性剂,引起细胞膜的脂肪酸成分的改变。 细胞内生物素水平高,Glu不能通过细胞膜 青霉素:抑制细胞壁的合成,由于细胞面内外的渗透压而泄露出来。 表面活性剂增加细胞膜通透性,氨基酸发酵必须考虑的重要因素,细胞透性的调节 细胞透性的调节,一般通过向培养基中添加化学成分(如生物素、油酸、甘油、表面活性剂、青霉素等,达到抑
12、制磷脂、细胞膜的形成或阻碍细胞壁的正常生物合成,使谷氨酸生产菌处于异常生理状态,解除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透障碍。 生物素:影响磷脂的合成及细胞膜的完整性。 油酸:直接影响磷脂的合成及细胞膜 甘油:甘油缺陷型菌株丧失-磷酸甘油脱氢酶,不能合成-磷酸甘油和磷脂。限量供应, 控制了细胞膜中与渗透性直接关系的磷脂含量,使谷氨酸排出胞外而积累。 表面活性剂:对生物素有拮抗作用,拮抗不饱和脂肪酸的合成,导致磷脂合成不足,影响细胞膜的完整性,提供细胞膜对谷氨酸的渗透性。 青霉素:抑制细菌细胞壁的后期合成,形成不完整的细胞壁,使细胞膜失去保护,使胞内外的渗透压差导致细胞膜的物理损伤,增大谷氨酸向胞外漏出
13、的渗透性、,生物素,阻断脂肪酸的合成,影响细胞膜的合成,表面活性剂,对生物素有拮抗,阻断脂肪酸的合成,影响细胞膜的合成,在对数生长期添加青霉素,抑制细胞壁合成,细胞膜损伤,甘油缺陷型,磷脂的合成受阻,影响细胞膜的合成,油酸缺陷型,阻断不饱和脂肪酸的合成,影响细胞膜的合成,提高细胞膜的 谷氨酸通透性,控制磷脂的合成 使细胞膜受损(如表面活性剂) 青霉素损伤细胞壁,间接影响细胞膜,控制磷脂含量,通过油酸的合成 通过甘油合成 直接控制磷脂合成,3、控制旁路代谢,4、降低反馈作用物的浓度,利用营养缺陷型突变株进行氨基酸发酵必须限制所要求的氨基酸的量。,限制瓜氨酸的浓度可解除反馈抑制,实现鸟氨酸的生物合
14、成。,5、消除终产物的反馈抑制与阻遏作用,使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法或者通过选育营养缺陷型菌株。,6、促进ATP的积累,以利氨基酸的生物合成,ATP的积累可促进氨基酸的生物合成,第四节、谷氨酸生物合成及其发酵生产调控,代谢控制发酵是用遗传学或其他生物化学的方法,人为 地在分子水平上改变和控制微生物的代谢,打破微 生物正常的代谢调节,使有用产物大量生成和积累。 氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵,发酵技术的关键是 打破微生物的正常代谢调节,人为控制微生物的代谢。,一. 谷氨酸的生物合成途径,1、谷氨酸生物合成中的几个途径(正常途径) (1)糖酵解途径 (EMP) (2)磷酸已糖途径 (HMP
15、) (3)三羧酸循环(TCA环) (4)乙醛酸循环 (DCA环) (5)二氧化碳固定反应 PEP+CO2+GTP 草酰乙酸+GDP 丙酮酸+CO2+NADH 苹果酸+NAD 草酰乙酸 CO2 NAD+ NADH+H+ (6)-KGA的还原氨基化反应,PEP羧化酶,苹果酸酶,苹果酸脱氢酶,C6H12O6 + NH3 + O2 C5H9O4N + CO2 + 3H2O,在GA产生菌菌体内CO2固定反应有以下两条途径:,苹果酸酶 丙酮酸羧化酶 磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶,CO2固定反应(丙酮酸羧化支路),2、GA生物合成的理想途径,(1)GA产生菌必须具备以下条件(内在因素 ),菌体有强烈的L谷氨酸脱氢
16、酶活性,KGA + NH4+ +NADPH = GA + NADP,提供NADPH,用于还原-酮戊二酸生成谷氨酸,形成氧化还原共扼体系,该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联,3/2Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸 + 丙酮酸,乙酰辅酶A + 乙酰辅酶A + 乙酰辅酶A,柠檬酸,则有: 3/2 C6H12O6 + NH4+ = C5H9O4N+ 4 CO2 产率:147 /(180*3/2) = 54.4%,CO2,谷氨酸,在前述GA 合成所必需的条件的基础上,体系不存在CO2固定反应,则有:,体系存在CO2的固定反应,结论,通过DCA环提供C4二羧酸时谷氨酸对糖的转化率仅为54.4
17、%,在谷氨酸发酵中,DCA环可以作为TCA循环有缺陷时C4二羧酸的补充,.在前述GA 合成所必需的条件的基础上(封闭乙醛酸循环)存在CO2固定反应,则有:,Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸,CO2,则有: C6H12O6 + NH4+ = C5H9O4 N + CO2 (来自何方) 产率:147 / 180 = 81.7%,乙酰辅酶A + C4二羧酸,CO2,草酰乙酸(草酰乙酸羧化酶),苹果酸(苹果酸激酶),柠檬酸(DCA循环封闭),谷氨酸,四碳二羧酸的来源,在生产菌中检出CO2固定反应酶活性,磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和苹果酸酶,谷氨酸对糖的转化率达到81.7%,C6H12O6
18、+NH3+1.5O2 C5H9O4N+CO2+3H2O,需要Mn+做催化剂,所以,在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn+ 实际上,发酵过程中不可能控制柠檬酸合成所需的C4二羧酸完全来自于CO2固定反应,体系也不可能完全不存在CO2固定反应,因此,GA 发酵的糖酸转化率应在:54.4%81.7%。目前,国内的GA生产企业的糖酸转化率通常都在50%以内:,提高GA的潜力是很大的,具体表现在: (1)强化CO2固定反应,具体措施:Mn+ ,生物素? (2)控制溶氧浓度是非常重要的 低的溶氧浓度,则丙酮酸向乳酸方向转化 高的溶氧浓度,则NADPH 有被氧化的可能,,氨的导入,合成谷氨酸的反应有3种:
19、,(2)影响谷氨酸合成的外在因素,a、生物素对糖代谢的影响,生物素参与糖代谢作用:增加糖代谢的速度(对TCA有促进作用),乳酸积累,碳源利用率降低,发酵液的pH值下降。,A、生物素对GA发酵的影响,主要影响糖降解速度,不影响EMP与HMP途径的比率。生物素充足的条件下,丙酮酸以后的氧化活性虽然也得到提高,但由于糖降解速度显著提高,打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡,丙酮酸趋于生成乳酸的反应,引起乳酸的溢出。,当VH缺乏时:,(1)丙酮酸的有氧氧化就会减弱?则:乙酰辅酶A的生成量就会少,醋酸浓度降低,它的诱导作用降低;通过控制生物素亚适量,几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性 (2)VH对TC
20、A循环的促进作用的降低,使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低,其浓度得到积累,这样它的阻遏和抑制作用加强;乙醛酸循环基本上是封闭的,代谢流向异柠檬酸-酮戊二酸谷氨酸的方向高效率地移动 两者综合的作用使得,异柠檬酸裂解酶的活性丧失,DCA循环得到封闭。,b、控制VH的浓度,以实现对于乙醛酸循环的封闭,c、生物素对氮代谢的影响,VH丰富时,出现“只长菌,不产酸”的现象,GA发酵过程中,前期,菌体的增殖期,一定的量的生物素是菌体增殖所必需的;而在产物合成期,则要限制生物素的浓度,以保证产物的正常合成。,结论,氨的导入时,生物素缺乏, NH4+影响糖代谢速度:提高糖代谢速度,高效合成谷氨酸,生物素充足时
21、, NH4+不影响糖代谢速度,关于氮代谢的调节: 控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力,使合成的谷氨酸不能转化成其他氨基酸或参与蛋白质合成。 在生物素亚适量的情况下,几乎没有异柠檬酸裂解酶,琥珀酸氧化能力弱,苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞,在铵离子适量存在下,生成积累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其他氨基酸和合成蛋白质。 在生物素充足的条件下,异柠檬酸裂解酶活性增强,琥珀酸氧化能力增强,丙酮酸氧化力加强,乙醛酸循环的比例增加,草酰乙酸、苹果酸脱羧反应增强,蛋白质合成增强,谷氨酸减少,合成的谷氨酸通过转氨作用生成的其他氨基酸量增加。,d、VH对菌体细胞膜通透性的影响,通常谷氨
22、酸发酵采用的菌种都是VH-,而VH又是菌体细胞膜合成的必须物质,因此,可以通过控制VH的浓度(干扰磷脂中的脂肪酸的生物合成)来实现的来实现对菌体细胞膜通透性的调节 。,葡萄糖,丙酮酸,+,丙酮酸,乙酰辅酶A,乙酰辅酶,乙酰辅酶A羧化酶 (辅酶是VH ),CO2,丙二酰辅酶A,丙二酰辅酶A,C4,C6,CO2,培养基中生物素限量时,胞内AA 92% 胞外,培养基中生物素丰富时,胞内AA 12% 胞外,CO2,Glu生产菌大多是生物素缺陷型,发酵时控制生物素亚适 量,使细胞变形拉长,改变了细胞膜的通透性引起代谢失 调使Glu得以积累。,生物素贫乏时,细胞内的Glu含量少而且容易析出,而培 养基中积
23、累大量的Glu;生物素丰富时,培养基中几乎不 积累Glu,而细胞内却含有大量的Glu,且不易被析出。 这说明生物素对细胞膜通透性有重要影响。,谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸生产菌细胞膜结构与功能发生特异性变化,使细胞膜转变成有利于谷氨酸向膜外渗透的形态,使终产物不断排出细胞外,胞内谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓度,胞内谷氨酸源源不断被优先合成,分泌到发酵培养基中积累。,B、供氧浓度,过量:NADPH的再氧化能力会加强,使-KGA的还原氨基化受到影响,不利于GA 的生成。 供氧不足:积累大量的乳酸,使发酵液的pH值下降,不利于GA的产生,同时,一部分葡萄糖转成了乳酸,影响了糖酸转化率,
24、降低了产物的提出率。,C、NH4+浓度,(1)影响到发酵液的pH值 (2)与产物的形成有关: 过低,不利于-KGA的还原氨基化;过高,产生谷氨酰胺。 NH4+的供给方式: (1)液氨 (2)流加尿素,D、磷酸盐,过量:(1)促进EMP途径,打破EMP与TCA之 间的平衡,积累丙酮酸,产生乳酸等 (2)产生并积累Val,,Val(1)可以抑制葡萄糖 丙酮酸,使GA的生物合成受到阻止 (2)消耗了丙酮酸,降低了糖酸转化率 (3)发酵液中的Val存在,严重的影响GA 的结晶、提出,研究证明:,谷氨酸生产菌种存在EMP途径的全部酶和HMP途径有关 的酶,TCA循环中的柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸能定量地
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