讲座PPT - 2011全国分子细胞生物学实验技术培训班.ppt
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1、临床科研设计和SCI论文策略,-RNA干扰技术的应用 湖南省生物医学信息专业委员会 长沙赢润生物技术有限公司,讲座提纲,一. 科研选题及设计:以SCI为目标 二. 临床样本在基因功能研究中的作用 三. RNA干扰技术在基因功能研究中的应用 四. RNA干扰技术在发表SCI论文中的应用,一. 科研选题及设计:以SCI为目标,SCI没有捷径,但是有小技巧和经验。 阅读文献是基础,必不可少。 他山之石,可以攻玉。 参考前人的经验,获得自己的Idea。,如何选题,部位 前人的经验: 发现某基因在肝癌组织中表达增高,并有很多机制。 我们的借鉴: 拜读大作后,茅塞顿开。查文献后,确定在乳腺癌中尚无人涉 及
2、,于是,SCI处女作出炉:某基因在乳腺癌组织中表达增高。 注:全身器官那么多,你只要看文献比较及时,比较多,不太 晚,总能找到合适的方向。,药物 前人的经验: 发现辛伐他汀有某种作用,能够治疗某种临床疾病, 且对其原理进行了研究,找到了相关基因。 我们的借鉴: 拜读大作后,联想到了阿托伐他汀,于是SCI处女作 出炉:阿托伐他汀对某疾病的治疗效果及其作用机制。 注:同一类的药物有那么多种,您完全可以换一种药 物拿来做一下试试。,机制 前人的经验: 发现某基因具有抗氧化应激的作用。 我们的借鉴: 拜读大作后,联想到氧化应激在好多疾病的病理机制 中都发挥作用,比如糖尿病肾病、糖尿病神经病变等 等,于
3、是SCI处女作出炉:某基因在糖尿病肾病中的 作用。 注:注意串联联想: 基因 机制 临床疾病 基因,上下游基因 前人的经验: 发现A基因具有某种作用。 我们的借鉴: 拜读大作后,联想到A基因的上游或下游基因是B基 因,是否也有这种作用?于是SCI处女作出炉:B基 因具有某种作用。 注: 需要一定的知识基础,但相对于机制来说简单一点。,家族基因或者相同作用的基因 前人的经验: 发现某种药物能够对TNF-产生影响。 我们的借鉴: 拜读大作后,联想到IL-6以及CRP都是炎症因子,有 可能这种药物对IL-6以及CRP也有影响,于是SCI处女 作出炉:某种药物对IL-6以及CRP的影响。 注:有相同作
4、用的基因有很多,注意联想。,如何设计自己的课题,不要把实验设计得过广。 只要在一点上面做得稍微有深度就行了。 不要用一个实验来证明N个结论,而是要用N个实验来证明一个结论-即使这几个实验都比较简单。 做出深度,做出层次来。,二. 临床样本在基因功能研究中的作用,确定目的基因和临床疾病之间的关系 确定目的microRNA和临床疾病之间的关系 通常是整个课题的起始,收集临床样本,RNA,DNA,Protein,microRNA芯片,基因芯片,组织芯片,RT-PCR或Real-time PCR,Western-blot,免疫组化,基因表达差异,确定目的基因,参考文献,microRNA研究,二. 临床
5、样本在基因功能研究中的作用,确定预研究的目的基因后,如何设计课题? 基因功能研究的两方面: A. 基因的过表达-基因表达上调; B. 基因的RNA干扰-基因表达下调。 两者相辅相成,互为佐证。 紧贴临床疾病的基因治疗这一目的。,三. RNA干扰技术在基因功能研究中的应用,3.1 靶位点的选择 & shRNA序列设计 3.2 shRNA表达载体构建 3.3 筛靶:确定最有效的shRNA 3.4 转染或感染目的细胞,表达shRNA 3.5 检测或验证RNA干扰效果 3.6 RNA干扰回复实验 3.7 动物模型实验,RNA干扰实验流程图,寻找靶位点,设计干扰序列,确定靶基因,参考文献,收集标本,比较
6、基因表达差异,参考文献或文库,设计全新序列,将shRNA片段装载至表达载体,转染或感染细胞,表达shRNA,普通质粒载体,病毒载体,检测或验证RNA干扰效果,外源筛靶,mRNA水平,蛋白质水平,细胞表型水平,动物模型,预实验:确定目的细胞质粒转染效率,包装病毒,体外法,体内法,RNA干扰回复实验,3.1 靶位点的选择 & shRNA序列设计,非常重要的一步!事半功倍 or 事倍功半? 现有免费软件设计:成功率较低(30%左右) 商业化软件或shRNA库:成功率高(75%以上),Yrbio shRNA库 让您的RNAi实验有一个良好的起点! 真正做到事半功倍! 包含TRC、Ambion等多个组织
7、或机构开发的shRNA库; 针对人及小鼠数万个基因,每个基因提供35条shRNA; 库中shRNA有效率高达75%!大部分shRNA干扰效率超过80%!,推荐,3.2 shRNA表达载体构建,TRC原装进口shRNA表达系统 优点: (1)原装进口产品,本公司未做任何改动。 (2)既可当作普通shRNA真核表达载体使用,同时也是慢病 毒包装系统中的穿梭载体,可以用来包装慢病毒。 缺点: (1)载体上没有荧光标记。 (2)慢病毒的生物安全性,对实验室条件要求较高。 (3)载体拷贝数较低,测序比较困难。,赢润shRNA表达系统 (1)shRNA序列数据依然来自TRC、Ambion shRNA数据库
8、, 质量有保证,靶位点成功率高。 (2)您可以选择构建一条或者多条shRNA,灵活度高。 (3)多种启动子,有荧光或无荧光,绿色荧光或红色荧光等 可自由选择,能够更好地配合后续实验。 (4)载体既可作为普通shRNA表达载体使用,亦可作为腺病 毒或慢病毒包装系统的穿梭载体使用,以进行腺病毒或慢病毒 包装。,3.2 shRNA表达载体构建,mirshRNA表达载体,3.3 筛靶:确定最有效的shRNA,内源筛靶、外源筛靶 什么情况下采用外源筛靶? (1)目的细胞暂时不易得到; (2)目的细胞转染效率较低(小于60%); (3)目的细胞需诱导才能表达靶基因; (4)目前尚无靶基因的抗体。,3.3
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