免疫比浊检验技术原理与进展.ppt
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1、免疫比浊分析技术原理与进展,桂林英美特生物技术研究所,一、免疫学基本原理 二、免疫沉淀 三、免疫比浊技术原理,免疫比浊检验技术原理与进展,一、免疫学基本原理,1、抗原与抗体 2、抗原抗体的结合免疫学反应 3、免疫学反应的检测技术,1、抗原与抗体,抗原(Antigen, Ag)是刺激机体产生免疫应答的物质。 “应” 是指抗原刺激机体产生免疫应答产物-抗体或免疫效应细胞 “答” 是指相应抗原与免疫应答产物结合并将其排除体外) 抗原的免疫原性和免疫反应性 完全抗原与半抗原 抗原表位与抗原结合价位,1、抗原与抗体,1、抗原与抗体,免疫原性 免疫原性(immunogenecity)是指抗原分子能够刺激机
2、体产生免疫应答(产生特异性抗体及免疫效应细胞)的性质。,Ag,抗体,免疫原性示意图,1、抗原与抗体,免疫反应性:是指抗原分子与免疫应答产物(抗体或免疫效应细胞)发生特异性结合的性质。,抗原性(免疫反应性)示意图,抗体,1、抗原与抗体,完全抗原(complete antigen) 具有免疫原性和抗原性的物质。 半抗原(hapten,又称不完全抗原 incomplete antigen )无免疫原性,只有抗原性的物质。 载体(carrier)赋予半抗原以免疫原性的蛋白质。 半抗原 + 蛋白质(载体) 完全抗原。,半抗原,+,载体,抗体,完全抗原,半抗原载体效应示意图 半抗原 + 蛋白质(载体) 完
3、全抗原,1、抗原与抗体,抗原决定簇:抗原分子存在的能TCR/BCR或抗体Fab片段特异性结合的特殊化学基团,是免疫应答特异性的物质基础。 构象决定簇 :构象决定簇(conformational determinant)由空间构象形成的决定簇,序列上不连续。 顺序决定簇:顺序决定簇(sequence determinant),又称线性决定簇(linear determinant),序列相连续的氨基酸肽片段构成的决定簇。 抗原结合价:抗原结合价(antigenic valence)是指能够与抗体分子结合的决定簇数目。,1、抗原与抗体,1、抗原与抗体,抗原表位的性质、数目、位置、空间排列和立体构象决
4、定着抗原-抗体反应的高度特异性。,1、抗原与抗体,共同表位(common epitope)指不同抗原之间含有的相同或相似的抗原表位。 交叉反应(cross-reaction)指抗体或致敏淋巴细胞对具有相同或相似表位的不同抗原均具有的反应(交叉结合)。,1、抗原与抗体,抗体(antibody, Ab)功能性概念 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。抗体主要存在血清中,也存在于如呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。 免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)结构性概念 具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。 抗体一定是球蛋
5、白,球蛋白未必是抗体,1、抗原与抗体,抗体的分子结构,1、抗原与抗体,“Y”型,四肽链 重链 (5种: 、 、) 轻链 (2种: 、) 可变区 (V区) 超变区( 又称CDR 互补决定区) 骨架区: FR 恒定区 (C区) 铰链区,1、抗原与抗体,根据重链抗原性的不同,免疫球蛋白可以分为5类: IgG (gamma) IgA (alpha) IgM (mu) IgD (delta) IgE (epsilon),1、抗原与抗体,根据轻链C区抗原性不同,免疫球蛋白可分为2型) (kappa)型 (lambda)型 轻链存在于各类免疫球蛋白中 同一个免疫球蛋白分子中的轻链同型,1、抗原与抗体,抗体的
6、生物学功能特异性结合抗原 超变区表位 静电力、氢键、范德华力 可逆 影响因素:PH、温度、电解质,结合基础,2、抗原抗体的结合免疫学反应,抗原抗体反应的原理 抗原与抗体能够特异性结合是基于两种分子间的结构互补性与亲和性,这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。 抗原抗体反应可分为两个阶段。第一为抗原与抗体发生特异性结合的阶段,此阶段反应快,仅需几秒至几分钟,但不出现可见反应。第二为可见反应阶段,抗原抗体复合物在环境因素(如电解质、pH、温度、补体)的影响下,进一步交联和聚集,表现为凝集、沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。 抗原抗体的结合使电荷减少或消失,蛋白质由亲水胶体
7、转化为疏水胶体。 四种分子间引力(电荷引力、范登华引力 、氢键结合力 和疏水作用 )参与并促进抗原抗体间的特异性结合。,2、抗原抗体的结合免疫学反应,典型的抗原抗体结合反应,特异性识别,形成抗原抗体复合物,2、抗原抗体的结合免疫学反应,抗原抗体反应的特点,特异性 按比例 可逆性,2、抗原抗体的结合免疫学反应,2、抗原抗体的结合免疫学反应,影响抗原抗体反应的因素 电解质(离子强度):抗原与抗体发生特异性结合后,虽由亲水胶体变为疏水胶体,若溶液中无电解质参加,仍不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成,常用0.85氯化钠或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释液。由于氯化钠在水溶液中解离成Na+和C1
8、,可分别中和胶体粒子上的电荷,使胶体粒子的电势下降。当电势降至临界电势(1215mV)以下时,则能促使抗原抗体复合物从溶液中析出,形成可见的沉淀物或凝集物。 酸碱度(pH):抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行。蛋白质具有两性电离性质,因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应一般在pH为68进行。PH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质,例如pH达到或接近抗原的等电点时,即使无相应抗体存在,也会引起颗粒性抗原非特异性的凝集,造成假阳性反应。 温度:在一定范围内,温度升高可加速分子运动,抗原与抗体碰撞机会增多,使反应加速。但若温度高于56时,可导致已结合的抗原抗体再解离,甚至变性或破坏;
9、在40时,结合速度慢,但结合牢固,更易于观察。常用的抗原抗体反应温度为37。每种试验都有其独特的最适反应温度,例如冷凝集素在4左右与红细胞结合最好,20以上反而解离。 其它:适当振荡也可促进抗原抗体分子的接触,加速反应。,3、免疫学检测技术,凝集与沉淀 比浊 电位、微天平,放射性核素标记 酶标记、荧光标记和胶体金标记 化学发光物标记或偶联化学发光反应,非标记免疫检测技术,标记免疫检测技术,二、免疫沉淀,凝集:细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原,在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集,称为凝集反应(agglutination)是最经典的免疫学检测技术。,二、免疫沉淀,免疫沉淀反应:(prec
10、ipitation) 可溶性抗原与相应抗体,在适宜条件下发生结合,出现的沉淀现象。,免疫沉淀,液体内沉淀反应,凝胶内沉淀反应,免疫电泳技术,免疫浊度技术,絮状沉淀试验,环状沉淀试验,单向扩散试验,双向扩散试验,试管法 平板法,免疫电泳 对流免疫电泳 火箭免疫电泳 免疫固定电泳,透射免疫比浊turbidimetermeasure 散射免疫比浊nephelomitermeasure,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,各管抗原倍比稀释,加入抗血清,各管抗体量不变,振摇 混匀、37孵育,沉淀量不同,试管内絮状沉淀试验,轻摇,絮,状,沉,示,意,图,淀,Ag,Ab Ag,
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