乙肝两对半检测中(南京).ppt
《乙肝两对半检测中(南京).ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《乙肝两对半检测中(南京).ppt(71页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、乙肝两对半免疫学检测相关问题研讨,中山三院检验科 李林,HBV感染的实验室检测是目前国内最为常见的检验项目,也是医患纠纷产生较多的领域之一。 卫生部临床检验中心 李金明 乙肝两对半: HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。 检测结果:定性、半定量、定量。 试剂原材料:抗原(天然抗原、重组抗原)、抗 体(单抗、多抗、Fab)。 检测技术: ELISA、化学发光、时间分辨荧光、免疫层析等。 检测方法:夹心法(一步法,两步法),竞争法(固相液相竞争法,液相液相竞争法等)。,一、HBsAg 方法:双抗体夹心法:两步法,一步法。 试剂原材料: HBsAb( McAb、 PcAb)或
2、其酶解产物 Fab 。,双抗体夹心法模式:,固相载体,Ab,Ag,标记Ab,HBsAg抗原表位 1、共同决定簇: a( aa124-147); 2、型特异决定簇: (1) d/y( aa122,赖氨酸/精氨酸); (2) w/r( aa160,赖氨酸/精氨酸); 四种亚型:adr、adw、ayr、ayw。,检测中常见的问题,1、一步法测定中的钩状效应(Hook effect):,一步法检测时,受检抗原的含量很高时, 过量抗原分别和固相抗体及标记抗体结合,而 不能形成 “固相抗体抗原标记抗体”夹心复 合物。此时反应后的检测信号位于抗原过剩带 上,与标准曲线位于抗体过剩带上的某一抗原 浓度的检测信
3、号相同,如按抗体过剩带上的检 测信号测读,所得结果将低于实际的含量,这 种现象称为钩状效应。钩状效应严重时,可出 现假阴性结果。,双抗体夹心一步法的钩状效应(示意图):,固相载体,固相Ab,Ag,标记Ab,钩状效应时分析浓度与检测信号关系图:,检测信号,抗体过剩带,抗原过剩带,抗原分析浓度,HBsAg检测试剂原材料与钩状反应的关系: 原材料:HBsAb。 多克隆抗体:免疫动物或直接从感染者血清中所获得,来源于不同的B细胞克隆,可含有针对同一抗原分子不同的抗原表位(a、 d/y、 w/r)的多种定向抗体。 单克隆抗体:由一株B细胞杂交瘤产生的只针对某一特定的抗原表位的高度均一,高度专一性的抗体。
4、,McAb制备的试剂受钩状效应的影响较PcAb为轻:,Ig的一个Fab片段只能与一个抗原表位结合。McAb为针 对同一抗原表位的均一抗体分子群。 HBsAg分子虽具有三个 不同的表位(a、d/y、r/w),但一分子HBsAg同样的表位只有 一个,只能封闭一个单体McAb的一个抗原位点,两分子抗 原才能封闭一个McAb单体。而PcAb为针对同一抗原不同表 位抗体分子群(抗a、抗d/y、抗w/r ),一分子HBsAg上不同的 表位可同时与针对不同表位的两个以上单体PcAb结合,其封 闭作用的效率高于对McAb。,McAb试剂的钩状效应,固相载体,McAb(抗a),Ag,标记McAb(抗d),PcA
5、b试剂的钩状效应,固相载体,McAb(抗a),标记McAb(抗r),标记McAb(抗d),钩状效应是HBsAg一步法检测时不可避免的现象; 由于钩状效应的存在,一步法检测HBsAg所得到的检测信号无法确定其真实性; 解决勾状效应的根本方法为固相抗体与抗原反应后分离游离抗原,再加标记抗体的两步法检测: 第一步:包被抗体捕获抗原成为固相,然后分离游离抗原;第二步:固相抗原与标记抗体结合,分离液相标记抗体后记录检测信号。,两步法检测:,固相载体,Ab,Ag,标记Ab,两步法检测时目的检测物浓度和检测信号关系曲线,检测信号,分析浓度,易误解为两步法的一步法检测: 1、标本生物素化抗体标记抗体 生物素化
6、抗体抗原标记抗体复合物; 2、加入亲和素包被的固相载体 固相生物素化抗体抗原标记抗体复物; 3、洗涤,判读结果。,2)人抗鼠抗体效应(Human anti-mouse effect, HAMA效应) 对检测的干扰,产生HAMA的原因:,经常接触老鼠; 肿瘤病人进行鼠单克隆抗体的治疗。,用鼠源McAb检测HBsAg时,如样品中有 HAMA,就会产生假阳性或假阴性。,非鼠源的PcAb可消除HAMA效应, IgFab(Fab)可消除HAMA引起的假阳性 。,HAMA效应的假阳性模式:标本中的人抗鼠抗体分别与固相HBsAb和标记HBsAb McAb结合,形成固相HBsAbHAMAHBsAb复合物(双抗
7、原夹心),提供假阳性检测信号。,固相载体,固相McAb,标记McAb,人抗鼠抗体,Human Anti-Mouse Antibodies (HAMA),HAMA效应的假阴性模式:,Figure 3-6 How HAMA generates a false negative,3) S基因突变引起的HBsAg漏检:,基因突变引起“a”决定簇内部一个或多个 氨基酸置换、缺失或插入,HBsAg 蛋白质氨 基酸组成发生改变,导致其抗原性产生变化。 变异率高 ,自然变异和免疫逃避,变异无 地域性。 HBsAg抗原性发生改变,不能被野生型 HBsAb所识别。 此时用一般的国产试剂盒可能 检不出。,能导致HB
8、sAg阴性的S区变异 145甘氨酸 精氨酸 aa124 半胱氨酸 酪氨酸 aa129 谷氨酸 天冬氨酸 aa131 苏氨酸 天冬氨酸 aa131 蛋氨酸 苏氨酸 aa122-124 插入氨基酸 前S1/S2部分缺失 不一定HBsAg抗原性发生改变后就一定漏检。很多时候野生型与突变型是混合存在的,这种情况虽然有突变,同样可以检出 。,4)RF引起的假阳性 RF是一种自身抗体,能和多种动物IgG的Fc段结合。由于固相抗体和标记抗体均为IgG,双抗体夹心法测抗原可能有RF的干扰,产生假阳性。,固相载体,固相IgG,标记IgG,RF,解决办法: 用IgG的Fab 或F(ab)片段作酶结合物替代完整的I
9、gG; 标本用联有热变性IgG的固相吸附剂(G蛋白)处理; 将热变性IgG加入到标本稀释液中; 离心分离IgM和IgG; 加入羊抗人IgG。 鼠源单克隆抗体对RF的亲和力较低,也能明显地降低RF对结果的干扰。,McAb和PcAb在HBsAg检测中的应用,McAb: 优点:在一步法检测中能减轻钩状效应;便 于人为处理和质量控制。 缺点:HAMA效应,灵敏度比不上PcAb。,PcAb: 优点:免疫反应性好于McAb,作为标记抗体, PcAb可能提供更强的检测信号,达到更高 的灵敏度;非鼠源PcAb 无HAMA效应。 缺点:一步法检测时钩状效应明显。,固相载体,HBsAg McAb (“a”),HB
10、sAg McAb (“a”),标记McAb (抗“d”),标记PcAb(抗“r”),McAb和PcAb在检测HBsAg(adr)时抗原 抗体结合示意图,标记PcAb (抗“d”),HBsAg,标记McAb (抗“d”),上述情况是指只采用一种McAb的情况,如果采用两种针对不同表位的McAb ,可以提高灵敏度,但同时也和PcAb一样,会发生明显的钩状效应。,常见HBsAg检测情况: ELISA 检测模式:一步法。 原材料:McAb; 检测结果:定性。 缺点:钩状效应,灵敏度较差,HAMA干扰、RF干扰,不能定量。 化学发光 检测模式:一步法。 原材料:McAb(Fab); 检测结果:定量。 灵
11、敏度好于ELISA,无RF干扰。 缺点:钩状效应, HAMA干扰,定量结果不能溯源到国际标准。,Abbott 检测模式:两步法。 原材料:McAb(固相捕获抗体),PcAb( Fab,标记抗体) ; 检测结果:定量。 优点:1)无钩状效应;2)无HAMA、无RF干扰; 3)灵敏度高; 4)加用了针对不同突变株病毒 抗原的检测抗体,可以进行HBsAg突变株的检 测; 5)定量结果可溯源到国际标准。 时间分辨荧光 检测模式:两步法。 原材料:McAb(固相捕获抗体),PcAb( 标记抗体) ; 检测结果:定量。 特点:无钩状效应;灵敏度高;无HAMA干扰。不能进行HBsAg突变株的检测, 可能有R
12、F干扰,定量结果不能溯源到国际标准。,目前国际上常用的HBsAg标准物质: Paul Ehrlich Institute 参考物: PEI/ml; 法国参考物: ng/ml; 雅培参考物: ng/ml(Axsym), IU/ml (i2000); NIBSC参考物:IU/ml. (英国国家生物标准与检定所,National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC) 1 IU/ml=0.58PEI/ml=1.93“法国”ng/ml=5.59雅培ng/ml,二、HBsAb 原材料:HBsAg 1、天然HBsAg :血源的纯HBsA
13、g,即S 蛋白(小球形颗粒);,HBsAg小球型颗粒(2022nm) Dane颗粒(40 42nm) 管型颗粒,2、基因工程重组抗原(rHBsAg)。,HBsAb为分别针对HBsAg五种表位(a、 d/y 、w/r) 的不同抗体,其中90%的HBsAb为针对“a”的抗体,为最 重要的保护性体,对不同亚型感染均有保护作用(但交 叉免疫不完全),也是HBsAb各种抗体中最重要的血清 标志物。 用于检测HBsAb的抗原,无论天然抗原或重组抗 原,必须具有“a”表位,一般为ad、ay亚性联合应用。 HBsAb试剂原材料质量优良,检测方法为双抗原夹心 法,定量定性检测的结果均准确可靠。,可能出现的问题:
14、 如包被物和酶标记物均使用血源球形颗粒,在提取过程中混入Dane颗粒会影响检测结果的特异性 。 原因: Dane颗粒核心结构中的HBcAg暴露; HBcAg降解为HBeAg抗原。,乙型肝炎病毒(Dane颗粒)结构模式,L蛋白,M蛋白,S蛋白,C蛋白,Dane颗粒暴露的HBcAg和降解生成HBeAg在制 备的试剂中也同时作为固相抗原和标记抗原。此时 检出的HBsAb,可能并非真阳性,而是HBcAg或/和 HBeAg夹心检出的HBcAb或/和HBeAb。,固相载体,HBsAg,HBsAb,标记HBsAg,HBcAg,HBcAb,标记HBcAg,假 阳 性 结 果,此时HBsAb假阳性结果将使两对半
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 乙肝 对半 检测 南京
链接地址:https://www.31doc.com/p-2160316.html