植生生化实验解读北大吴光耀.ppt
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1、2011年精英教案第五届全国中学生物竞赛培训,植生、生化实验解读课 北京大学生命科学学院 吴光耀 教授,1. 蛋白质测定,(1) 总N量测定 有机N(甘氨酸) + H2SO4 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 (NH4) 2SO4 + 2NaOH 2H2O + Na2SO4 + 2NH3 NH4HB4O7+ HCl + 5H2O NH4Cl + 4H3BO3 用酸滴定氨,1. 蛋白质测定,(2) 双缩脲法 测两个以上的肽键 碱性环境双缩脲与Cu+生成紫红色化合物 540nm (NH2) 2CO 2 NH2-CO-NH-CO-NH2 +NH3,1. 蛋白质测定,(3) Folin
2、-酚法 是改进的双缩脲法 640nm 同时测定了酪氨酸酚基。,1. 蛋白质测定,(4) 紫外法 280nm 比色,1. 蛋白质测定,(5) 考马斯亮蓝法 考马斯蓝G-250可与蛋白结合, 从红色染料转变成蓝色。 595nm 测定吸收值,2. 核酸测定,(1) RNA 测定地衣酚法 RNA + HCl 糠醛(核糖转变) 糠醛 + 3,5-二羟基甲苯(地衣酚) 鲜绿色 670nm比色,2. 核酸测定,(2) DNA 测定 二苯胺法 DNA + 冰乙酸 羟酮基戊醛(脱氧核糖转化) 羟酮基戊醛 + 二苯胺 蓝色 595nm 比色,2. 核酸测定,(3) 定磷法 有机磷 + 高氯酸 无机磷 无机磷 +
3、磷钼酸钼蓝 660nm 比色,2. 核酸测定,(4) 紫外法 260nm 比色,3. 质粒DNA提取和测定,(1) 扩增质粒 LB + 氨苄青霉素 (2) 细菌裂解 +碱 (质粒DNA出来, 染色体DNA变性) (3) 沉淀蛋白 +乙酸钾、酚-氯仿 (4) 纯化质粒DNA 水相质粒DNA用乙醇沉淀 + RNase 溶于Tris缓冲液中 (5) 260nm测定, 或电泳测定,4. DNA平板电泳,(1) 制胶 Tris-硼酸缓冲液(TBE) + 1%琼脂糖 (2) 加液 TBE液 (3) 加样 样品 + 花青素 (4) 电泳 滤光板看DNA移动过程,5. PCR (Polymerase chai
4、n reaction) - DNA扩增,(1) 模板、引物、dNTP、聚合酶、缓冲液、Mg+ (2) 过程: 模板双链分开 结合引物 新链合成 (3) 可用毛囊DNA Y染色体DNA, 设计引物,PCR, 男有女无.,播放动画,6. 层析,(1) 分配层析 纸层析、液相层析 (2) 吸附层析 活性碳、氧化铝 (3) 交换层析 离子交换剂 (4) 凝胶层析 Sephadex Sepharose Superdex,7. 糖的测定,(1) 萘酚反应 糖 + 酸 糠醛 +萘酚紫环反应 (2) 蒽酮反应 糖 + 蒽酮+硫酸兰绿色,7. 糖的测定,(3) 间苯二酚反应 酮糖 + 酸 羟甲基糠醛 +间苯二酚
5、 鲜红色 (4) 甲基间苯二酚反应 戊糖 + 酸 糠醛 +地衣酚 兰色沉淀 己糖 - 褐色沉淀,8. 还原糖测定(有自由醛基),(1) 费林反应 葡萄糖 + Cu(OH) 2+ NaOH 氧化亚酮 红黄色,9. 叶绿素性质,双羧酸的酯 酯溶性. 非极性溶剂(正己烷、石油醚) 荧光 +HCl 去镁叶绿素 +乙酸铜铜代叶绿素 +NaOH 皂化,10. 线粒体氧化磷酸化,磷氧比(P/O): 这一电子传递链过程中, 形成ATP的量与消耗氧分子之间的比为磷氧比,11. 希尔用离心机分离了菠菜叶绿体, 他在分离叶绿体中加入氧化态的氧化还原剂-2,6二氯靛酚(DCIP) 后照光, 发现DCIP被还原(氧化态
6、兰色, 还原态无色), 并有氧的释放 。,回答问题: (1) 你认为分离叶绿体要下述哪些条件,A. 一定pH的缓冲液 B. 溶液有一定的渗透势 C. 离心分离的叶绿体用水悬浮 D. 离心时,离心速度愈高愈好 E. 在摄氏4度操作和离心最好 F. 在室温操作最好,回答问题: (1) 你认为分离叶绿体要下述哪些条件,A. 一定pH的缓冲液 B. 溶液有一定的渗透势 C. 离心分离的叶绿体用水悬浮 D. 离心时,离心速度愈高愈好 E. 在摄氏4度操作和离心最好 F. 在室温操作最好,回答问题: (2) 你认为这一实验证明了什么?,光反应产生氧 B. CO2被还原 C. 光反应产生还原剂 D. 水被光
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