浙江大学生物化学实验甲质粒DNA的小批量提取与鉴定.ppt
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1、质粒DNA的提取与电泳鉴定,1、质粒简介 质粒是一种寄生性的自主复制子,存在于细菌等细胞中,为双链闭环的DNA分子,大小为1kb200kb之间,具有自主复制和转录的能力,但其复制和转录要利用宿主细胞(细菌)编码的一些酶和蛋白质。 2、分离纯化质粒的原理 分离纯化质粒DNA主要是利用宿主染色质DNA与质粒DNA之间的差异来进行的。,质粒DNA的提取与电泳鉴定,细菌DNA与质粒DNA形状上均为双链环形,但二者的分子量相差较大,细菌DNA的分子量在109D左右,而质粒DNA的分子量仅为106 107D, 提取纯化质粒的过程中,细菌DNA大多断裂成线状分子,而质粒DNA则多数仍为双链环状,从而即可将二
2、者分开。 本试验采用微量碱变性法来分离纯化质粒DNA,具体的分离纯化原理如下:,0,质粒DNA的提取与电泳鉴定,质粒DNA的天然结构为共价闭环(超螺旋)结构,但在制备过程中,由于各种因素的影响,同一质粒DNA的分子可能呈现出如下几种构型: 超螺旋型(共价闭环)质粒DNA:(cccDNA)超螺旋状。 开环质粒DNA:(ocDNA)质粒DNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂,从而形成松弛的环状分子。 线状质粒DNA:(linearDNA)质粒DNA的两条链在同一处断裂,从而变为线状分子。,质粒DNA的提取与电泳鉴定,电泳时,由于分子形状的不同,三种质粒DNA的泳动行为不同,根据电泳迁移率从小到
3、大的顺序分别为开环质粒DNA、线状质粒DNA和超螺旋质粒DNA。 3、DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定原理 核酸是一种两性电解质(碱基、磷酸),在pH8.0下,核酸带负电荷,电泳时向正极移动,根据核酸分子所带电荷的多少,分子的大小及构型的差异,可用电泳的方法对核酸进行分离和鉴定。,质粒DNA的提取与电泳鉴定,电泳中所使用的支持介质有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶,核酸中常用琼脂糖凝胶。 不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离200bp50kb的DNA片断,通过在琼脂糖溶液中加入低浓度的莹光染料溴乙锭(EB),在紫外光下即可检测出10ng的DNA条带。 当用琼脂糖凝胶电泳法检测质粒DNA样品时,根据条带的位置即可知
4、道质粒分子的三种构型及其比例,,质粒DNA的提取与电泳鉴定,此外,还可了解质粒样品中的杂质,如RNA、染色体DNA、蛋白质等的污染程度。电泳时如用已知分子量的核酸作对照,还可测定样品核酸的分子量。 4、材料与试剂 、试验材料 含有pUC系列、PSK等高拷贝质粒的菌株。 、试验试剂 试验试剂及使用时的注意事项解说详见P144及P147。,质粒DNA的提取与电泳鉴定,5、操作步骤 、质粒的提取 质粒提取的操作方法及注意事项解说详见P145。 、电泳鉴定 胶浓度:0.7% 各步操作方法及注意事项解说详见P148。 6、实验结果及处理 仔细观察纯化过程中各步试验现象。 仔细观察电泳后荧光带的显示情况,
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