细胞工程第五章.ppt
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1、第五章 细胞融合与单克隆抗体技术,第一节 细胞融合,一、细胞融合的发展简史 二、细胞融合的基本技术 三、融合细胞的筛选 四、细胞融合的应用 五、融合细胞的克隆化,细胞融合是指在离体条件下用人工方法将不同种生物或同种生物的不同类型的细胞通过无性方式融合成一个细胞的技术。,一、细胞融合的发展简史,1838年Muller第一个描述了脊椎动物肿瘤细胞融合成多核细胞的现象。 1873年,Luginbuhl 在天花脓瘪周围组织中观察到多核细胞。 1907年,体外组织培养技术成功之后,人们观察到体外培养的细胞也能融合而形成多核巨细胞。 1958年,日本冈田善雄(Okada)用高浓度的仙台病毒(Sendai
2、Virus)在体外成功地融合了小鼠艾氏腹水癌细胞后,细胞融合技术,得到迅速发展。,1960年,法国的Barski等首先发现不同类型的细胞在混合培养过程中自发融合的现象。 1966年,Yerganian进一步用仙台病毒获得了能够增殖的杂种细胞。 70年代,童第周在我国率先开展了这方面研究,将正常细胞与肿瘤细胞融合,证明正常细胞具有抗肿瘤效应。,二、细胞融合的基本技术,细胞虽在体外培养条件下会自发融合,但频率极低,故一般均须添加具有诱导细胞融合效应的生物或化学因子(融合剂),或采用电融合技术,人为地促进细胞融合。 人们把这种可以促进细胞融合,提高融合率而加入的生物试剂或化学试剂叫作细胞融合剂。,细
3、胞融合示意图,1、细胞融合的机理,细胞融合实际上包含多个过程: 首先是两个亲本细胞并列,细胞膜接触,以后膜组织局部破坏,最终形成包围融合细胞的连续胞膜。 融合细胞表面的特征性变化,有膜成分和胞质成分交流以及细胞内电导率的连续性。,病毒融合剂(p82):,最早被采用病毒融合剂有疱疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等在内的病毒类融合剂。 灭活仙台病毒介导细胞融合过程可以大大提高融合频率。它在病毒类融合剂中最为有效,使用最广。,使用仙台病毒诱导细胞融合步骤,制备细胞悬液 紫外线灭活2分钟(使仙台病毒失去致病性,仅起融合因子的作用) 混合亲本细胞(高pH高Ca2+,加入灭活病毒8-10分钟) 杂种细胞的筛选
4、,化学融合剂:, 常用PEG 优点:融合成本低,不需特殊设备;融子合产生的异核率较高,融合过程不受物种限制 缺点:可能会对细胞造成伤害,桥梁,示意图,PEG诱导细胞融合的效果: 同其分子量大小及浓度高低相关。常用分子量为10006000,浓度为3050 须严格掌握PEG的处理时间。 悬浮法,处理12分钟为宜。 离心法,先将细胞混合物悬于3040的PEG中,再通过离心进行融合,可适当延长接触时间,以58分钟为宜。随后,均须立即加液稀释,以及时终止PEG作用。 PEG溶液的pH7.48.0,电融合技术:,常用:细胞融合仪 电融合技术的原理: 1)细胞膜的接触(交流电) 2)细胞膜的击穿(直流电),
5、电融合法原理,交流电场使细胞膜表面电荷偶极化,沿着电极排列,形成串珠。,施加直流电场后,形成串珠的细胞在质膜接触处发生穿孔,开始遗传物质的交流。,电融合技术的优点,不存在对细胞的毒害问题 融合效率高 融合技术操作简便,三、融合细胞的筛选,融合细胞的类型 1)两个完态细胞的融合:同核体、异核体 2)两个非完态细胞的融合:核质杂种、胞质杂种,1药物抗性突变型的筛选,药物抗性突变型:细胞突变后对某一种药物的抗性显著增加而形成的一种突变型。 当把正常的野生型细胞培养在含有这一药物的培养基上,逐渐增加药物浓度,便可得到一条存活曲线(surival curve)。但是存在一些自发突变,这一细胞在药物的致死
6、浓度中仍能生长。,0.01,0.1,1,10,100,细胞活存率(log比例),野生型,抗性突变型,增加药物浓度,A,糖 + 氨基酸 核 苷,从头合成途径 (能被氨基碟呤阻断),“补救”途径 (包含HGPRT和TK酶),DNA,DNA合成途径,培养基中加入嘌呤类似物 (N-鸟嘌呤),细胞正常生长 (HGPRT-),细胞死亡 (HGPRT+),可通过嘌呤类似物来筛选HGPRT-细胞,正向选择,从头合成途径,HAT选择培养基含: 次黄嘌呤(hypoxanthine) 氨基蝶呤(aminopterin) 胸腺嘧啶(thymidine) 氨基蝶呤可阻止从头合成途径的过程,所以细胞内HGPRT活性必须恢
7、复,细胞才能存活。对于这类回复突变型的选择称为反向选择(reverse selection),补救途径,HAT培养基,细胞正常生长 (HGPRT+),细胞死亡 (HGPRT-),从头合成途径,培养基中含BrdU,细胞正常生长 (TK-),细胞死亡 (TK+),TK也可作为一种选择性标记,2营养缺陷突变型的筛选,营养缺陷突变型是培养细胞突变型中的另一种重要突变类型。这些突变型表现在合成低分子量代谢物(如氨基酸,嘌呤、嘧啶等)的能力发生了改变,以致这些细胞所产生的生物量不能满足正常生长的需要。,营养缺陷型细胞是指,在一些营养物(如氨基酸、碳水化合物、嘌呤、嘧啶或其他代谢产物)的合成能力上出现缺陷,
8、而难以在缺乏这些营养物的培养基中存活的变异型细胞。,例:,缺乏甘氨酸和脯氨酸的培养基上,甘氨酸营养缺陷型细胞 脯氨酸营养缺陷型细胞 融合细胞,死亡 死亡 存活,培养,3温度敏感突变型的筛选,较高温度生长的细胞,较低温度生长的细胞,两种温度存活,4.荧光激活细胞分选仪(FACS)筛选,不同荧光标记的脂质染料分别标记两亲本细胞,融合细胞因发两种荧光而被筛选出来。,四、细胞融合的应用,1淋巴细胞杂交瘤 2基因定位 3遗传基因的缺陷互补 4分化功能的表达调控研究 5. 体细胞杂种的致癌性分析 6. 制作疫苗 7. 核移植和动物克隆,五、融合细胞的克隆化,1、克隆化的目的,1) 是细胞建株的必经过程,以
9、得到遗传特征相同的细胞; 2) 就杂交瘤而言,可从中筛选出稳定而同源的杂种细胞系,淘汰遗传不稳定的杂交瘤细胞。 3) 减少非分泌型无关细胞生长过快。,2、饲养细胞的种类,对于培养小鼠细胞来说,主要有下列各种细胞可供作为其饲养细胞: 胸腺细胞; 正常的脾细胞; 传代培养中的大鼠胚胎成纤维细胞; 腹腔细胞,是使用得最普遍的饲养细胞。,3、克隆化培养方法:,按其分离单细胞的方法不同,大致可分为有限稀释法、软琼脂平板法、显微操作法及荧光激活细胞分类器法等数种 。,1)、有限稀释法,有限稀释法原理是从理论上将细胞稀释到10个/ml,然后装成每小孔(96孔板) 0.1ml,使每孔理论上含有单个细胞,经过培
10、养后即可获得单个细胞形成集落 。,2)软琼脂培养法:,利用单个细胞在软琼脂培养基上的局限化生长,待细胞集落长到肉眼可见后,用巴氏吸管从琼脂上挑出来(一般810天后),再移到液体培养基中,进行生长繁殖,并检测培养上清液的活性。,3)显微镜操作法,在倒置(或解剖)显微镜下,借助于毛细吸管将单个细胞个别吸出,分别放入已加饲养细胞的96孔培养孔内,根据原理不同,又分为普通法和玫瑰花结两种方法。,普通显微镜操作法,于6cm平皿中加入约103个细胞, CO2培养基箱中静置1小时左右 无菌条件,在倒置显微镜下去平皿盖 用直角转头滴管,吸出单个细胞,移至预先加有饲养细胞的96孔板内 直至96孔均分装有细胞,加
11、盖, 于CO2培养箱内培养 观察与更换培养方法同有限稀释法,原理:分泌抗体细胞在其表面含有抗原受体,在定的条件下常可与特异性抗原致敏的绵羊红细胞(SRBC)形成玫瑰花结。,玫瑰花结,106个/ mL杂交瘤细胞1致敏的SRBC 100mL,在显微镜下可见玫瑰花结形成细胞,挑玫瑰花结细胞入96孔板培养,细胞生长集落,酶联免疫吸附(ELISA)鉴定,4)盖片分离法,用钉锤于洁净的橡胶上砸干净盖片 选择碎块、大小形态适用的选出 加培养液及进行细胞培养 倒置镜下选细胞,挑出单细胞玻片 进行单个细胞培养,5)荧光激活细胞分离器法(FACS),原理是将悬液中的细胞引入一种液流的中央,使其一个接一个地通过聚焦
12、的高能激光束,根据荧光和光放射的性质快速分析和分离细胞。 荧光染料: Hoechest33258,第二节 单克隆抗体,一、单克隆抗体制备过程 二、单克隆抗体的特性 三、 单克隆抗体的应用,一、单克隆抗体的制备过程,(一)原理 (二)制备过程 (三)融合细胞的早期观察,(一)、原理,正常的可产生抗体的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞在融合剂的作用下产生融合,杂交的细胞在HAT选择培养基中进行培养,得到的为杂交瘤细胞,该细胞既具有可分泌抗体的功能又可在体外大量增殖。,(二)、制备过程,1细胞培养材料的准备 2亲本选择 3细胞融合 4杂交细胞的筛选 5. 杂交瘤细胞的克隆培养 6.单抗的生产,1细胞培养材料的
13、准备(p79),1)培养基:DMEM;RPMI-1640培养基 2)血清:胎牛血清最好,一定选用同一批次的血清,用前要灭活并做细菌学监测。 3)抗生素:防止污染,2亲本选择,一般选用与骨髓瘤细胞供体细胞来源同一品系的动物进行免疫,常采用BALB /c小鼠。 免疫动物的数量要多于用量。,2亲本选择,1)瘤细胞(p81) 选择原则: a):丧失自身合成免疫球蛋白的能力 b):对选择剂敏感(易从选择性培养基上除去) c):处于对数生长期(若用冻存细胞,应在融合前一周复苏),2亲本选择,1)瘤细胞 常用: 小鼠的HGPRT-骨髓瘤细胞 在应用前用8-AG处理,确保HGPRT-;杀死回复突变物HGPRT
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