基于二代测序技术在头颈部鳞癌驱动基因筛选及个体化治疗中的应用-国家肿瘤中心个体化医学平台建设项目申报书.doc

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1、编号： 项目类别：生物样本库建设项目 R分子诊断平台建设项目国家肿瘤临床医学研究中心个体化医学平台建设项目申报书项目名称：基于二代测序技术在头颈部鳞癌驱动基因筛选及个体化治疗中的应用申请资助经费数额：10万元项目负责人：王旭东主承担科室：颌面耳鼻喉科联系人：王旭东联系电话： 13011338181 通讯地址：天津医科大学肿瘤医院E-mail: WXD填报日期：2014/07/28 二一四年七月一、项目信息表项目基本信息项 目 名 称基于二代测序技术在头颈部鳞癌驱动基因筛选及个体化治疗中的应用所属专项名称国家肿瘤临床医学研究中心个体化医学平台建设项目项目类别生物样本库建设项目 R分子诊断平台建设

2、项目现处阶段应用基础研究起止时间2014年8月-2017年8月项目主要优势社会效益显著技术领域医药应用领域应用基础研究技术来源自有前期资助情况项目负责人及项目组情况项目负责人姓名王旭东性别男年龄47职务科室副主任职称主任医师学位博士学位专业肿瘤学毕业院校天津医科大学留学国别美国回国日期2010.08.人才种类院跨世纪人才身份证号120101196712022512电话23340123传真手机130111338181电子邮箱其他主要成员姓名性别年龄所在单位身份证号学位职称吴延升男天津医科大学肿瘤医院371428198109013518硕士主治医师岳恺男天津医科大学肿瘤医院120106198503

3、016512硕士医师刘速女天津医科大学肿瘤医院150429199001060020学士硕士生何清华男天津医科大学肿瘤医院371327198703060630学士硕士生段远胜女天津医科大学肿瘤医院371311198910063147学士硕士生总人数留学回国人数其中（按职称）培养人才正高级副高级中级初级其它博士后博士生硕士生7110113022其他实施单位情况单位名称主要承担研究任务第一合作单位第二合作单位协作单位项目简介立项目的与必要性(限250字以内)头颈部鳞癌是头颈部常见的恶性肿瘤，是严重威胁人类健康的重大疾患。其具有较强的侵袭能力，易于复发和转移,临床资料显示复发和转移是影响预后的重要因素

4、。目前，尽管采用包括手术治疗、化学治疗、放射治疗和靶向治疗等综合治疗手段使局部控制率有所改善，但5年生存率仍难于有效提高。筛选与头颈部鳞癌复发和转移的驱动基因，预测肿瘤的复发和转移的风险，指导肿瘤的个体化治疗以有效提高患者的生存率，是临床亟待解决的实际问题。工作基础及已具备条件(限200字以内)申请者及其研究团队多年来长期从事头颈部鳞癌转移机制及靶向治疗的研究，承担多项教委及科委课题，积累了丰富的经验，熟练掌握分子生物学的各项实验技术。已发表相关论文5篇。所在的头颈外科，每年完成头颈部鳞癌患者手术300余例，临床标本丰富，能够满足课题的需要。与天津市肿瘤防治重点实验室有良好的合作关系、可以保证

5、二代测序的顺利完成。 总体目标(限200字以内)总体目标：1）应用二代测序技术检测已知癌相关基因在头颈部鳞癌中的突变情况； 2）通过统计学处理筛选与头颈部鳞癌复发和转移相关的基因；3）建立预测头颈部鳞癌复发和转移风险的数学模型，为个体化治疗提供依据。主要研发内容(限250字以内)主要研发内容：1）应用二代测序技术检测200例头颈部鳞癌中已知的48个癌相关基因的突变情况；2）进行生物信息学分析、聚类分析，分别筛选出与复发和转移相关基因；3）利用筛选出的头颈部鳞癌的驱动基因及主要突变点，并结合临床病理资料，进行统计学分析，利用COX风险模型，建立头颈部鳞癌复发和转移风险的数学模型。预测复发和转移的

6、风险，指导个体化治疗。主要创新点(限200字以内)主要创新点：1）应用二代测序技术高通量筛选与头颈部鳞癌复发和转移的相关基因，目前尚未见报道；2）头颈部鳞癌复发和转移风险的COX数学模型的建立，预测复发和转移的风险，指导个体化治疗，具有良好的临床应用价值。工作进度安排(限200字以内)（按半年填写）2014.08-2015.02：收集天津医科大学附属肿瘤医院头颈部鳞癌临床病例资料，进行分类。2015.02-2015.08：根据所收集临床病例资料，收集天津医科大学附属肿瘤医院组织标本库 中头颈部鳞癌手术或者咬检标本。2015.08-2016.02：应用二代测序技术检测200例头颈部鳞癌标本中48

7、个已知癌相关基因的突变情况。2016.02-2016.08：对检测结果进行聚类分析，分别筛选出与复发和转移相关基因；利用筛选出的相关基因建立头颈部鳞癌复发和转移风险的COX数学模型。2016.08-2017.02：完成实验研究临床资料数据分析与总结，撰写研究论文并投稿2017.02-2017.08: 汇总整体实验研究结果，对实验过程中发现的兴趣点进行后续研究主要考核指标（限400字以内）1 可获得的成果（项目完成时可达到的阶段，具体技术成果等）：1）通过二代测序技术检测已知癌相关基因在头颈部鳞癌的突变情况，筛选出与头颈部鳞癌复发和转移相关的基因；2）建立预测头颈部鳞癌复发和转移风险的COX数学

8、模型，为个体化治疗提供依据。2 效益指标（社会效益等）：头颈部鳞癌复发和转移风险的COX数学模型的建立，可有效地预测肿瘤复发和转移的风险，更为精确地评估预后并指导个体化治疗；所筛选出的与复发和转移相关的基因，为进一步探究头颈部鳞癌的复发和转移机制及靶向治疗提供依据，具有良好的临床应用价值和社会效益。3考核指标（按照项目指南要求填写）：研究项目结题应满足以下条件之一：1)发表论文4篇，其中SCI收录两篇；2)建立评估头颈部鳞癌复发转移风险的数学模型；3)临床试验一项；成果应用后可取得的成效展望(限150字以内)头颈部鳞癌复发和转移风险的COX数学模型的建立，可有效地预测肿瘤复发和转移的风险，更为

9、精确地评估预后并指导个体化治疗，具有良好的临床应用价值和社会效益。所筛选出的与复发和转移相关的基因，为进一步探究头颈部鳞癌的复发和转移机制及靶向治疗提供依据，为后续深入开展针对发现的癌相关基因的下游调控功能研究提供重要线索；有助于阐明头颈部鳞癌复发和转移的分子机理并制定相对应的防治策略。其它需要说明的情况(限150字以内)不存在知识产权争议 资 金 预 算 （单位：万元）资金来源预算金额其 中2014年2015年2016年2017年来源合计105050其中拨款105050自筹资金支出预算金额其中：申请拨款计算依据资金总额1010其中人员费设备费能源材料费77试验外协费租赁费信息费11差旅费会议

10、费0.50.5国际科技合作与交流费管理费1.51.5特别说明：无项目负责人及其项目组承诺：1.本申请书提供的材料真实可靠，不存在知识产权争议；2.项目信息表中所填内容与项目实施方案、经费预算书等材料完全一致；3.我们将严格按照项目管理办法认真履行项目合同，采取一切措施确保项目进度和达到预期目标和技术经济指标；4.按照科技经费开支范围使用资助经费；5.其它（请叙述）：项目负责人签名（亲笔）： 年 月 日第二合作单位承诺：我们将认真履行合作单位职责，确保项目按合同完成。负责人（签字）： （单位公章） 年 月 日第三合作单位承诺：我们将认真履行合作单位职责，确保项目按合同完成。负责人（签字）： （单

11、位公章） 年 月 日主管部门审批意见：（单位公章）负责人（签字）： 年 月 日（一）项目的意义、必要性和依据1国内外相关领域发展水平和趋势1.1 项目的研究意义头颈部鳞癌(Head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)是头颈部常见的恶性肿瘤，是严重威胁人类生命和健康的的疾患，为世界六大常见恶性肿瘤之一。头颈部鳞癌在全世界范围内每年新发病例超过50万例，约占所有恶性肿瘤发病率的44，造成约30万例患者死亡，且发病率有逐年升高的趋势【1】。头颈部鳞癌具有较强的局部侵犯能力易于复发，并伴多有颈部淋巴结和/或远处转移【2】，研究表明，复发和转移是影响其预后的

12、重要因素【3】。尽管近年来对HNSCC采用以手术为主辅以化学治疗、放射治疗及靶向治疗的综合治疗手段，使肿瘤的局部控制率有所改善，但是其 5 年生存率仍然徘徊在 50%左右，难以得到有效提高【4】。目前，许多学者提出个体化治疗的理念，希望通过对头颈部鳞癌患者有针对性的治疗，有效提高患者的治疗效果。1.2 肿瘤的个体化治疗的理念及其应用近年来个体化治疗理念在肿瘤领域已被广泛接受，所谓的肿瘤个体化治疗( individualized therapy),是指所制定的治疗策略特别适合某一个肿瘤患者，而个体化的肿瘤治疗策略, 必须依赖临床因素, 更必须依赖功能基因组学的因素。因此, 基于功能基因组学的肿瘤

13、个体化治疗, 有可能让我们对每一个肿瘤患者量体裁衣, 设计出只针对这一患者的独特的、到目前为止有最好效果和最低毒副作用的治疗方案。基因检测能够识别患者个体差异，是制定个体化治疗方案、提高治疗缓解率、改善患者生存受益、有效实现个体化治疗的关键步骤和重要途径。目前，在肿瘤个体化治疗领域中，非小细胞肺癌( non-small-cell lung cancer，NSCLC)和乳腺癌的靶标基因研究最为深入和广泛。在NSCLC中，检测化疗疗效相关靶标基因主要包括ERCC1、RRM1、TUBB3、STMN1、ERCC2 和XRCC1等，靶向药物疗效相关靶标基因主要包括EGFR、ALK、Ros1、K-Ras、

14、BRAF、PI3-KCA、HER2 和MET等【5,6】；研究表明：基因检测有助于预测早期NSCLC 患者的术后复发、生存及其对辅助治疗的获益情况，可为晚期NSCLC 患者的药物选择及治疗方案的制定提供直观、科学的依据【7,8】。针对乳腺癌相关基因的靶向药物治疗也逐渐进入临床，如表皮生长因子受体( epidermal growth factor receptor，EGFR) 【9】 和酪氨酸激酶抑制剂( tyrosine kinase inhibitor，TKI) 【10】，并取得的令人满意的治疗效果。我们团队前期开展了头颈部鳞癌相关基因的研究，希望推动个体化治疗在头颈部鳞癌中的应用，研究发现

15、VHL表达缺失与头颈部鳞癌的转移、预后、EMT密切有关，重新表达VHL后，细胞形态学发生明显变化，肿瘤发生迁移，增殖，侵袭和EMT的能力都被抑制，Snail,、N-cadherin、MMP-2/9,、HIF-1a and VEGF 的表达被下调，而E-cadherin的表达上调【11】。对CXCR4的研究发现淋巴结转移中CXCR4的表达高于非淋巴结转移组,且CXCR4与Twist、Snail及N-cadherin的表达呈正相关,而与P-catenin呈负相关，CXCR4 SiRNA具有诱导舌癌细胞调亡、抑制经典Wnt通路参与舌癌EMT发生（如图4,5）,从而抑制舌癌细胞侵袭转移的能力，CXCR

16、4可成为抑制口腔鳞癌EMT发生的有效靶点【12】。有文献报道，约80%90%的头颈部鳞癌存在EGFR的高表达【13】，EGFR活化高表达会使EGF及TGF-与该受体结合增多，导致DNA合成、细胞增殖活跃、凋亡减少、侵袭性增加、可转移、血管生成及一些生长因子的转录，提示EGFR是一个提示不良预后的重要分子标志物，且对放疗和细胞毒药物抵抗【14、15】。1.3 二代测序技术在基因检测中的应用基因突变是在多数人类恶性肿瘤的直接原因,约50%的人类癌症中都存在着p53 突变, APC 基因与大肠癌的发生密切相关【16-18】。因此, 基因突变的检测具有重要的意义, 传统检测基因突变的方法主要为核酸分子

17、杂交, 但是此方法过于繁杂, 且容易对人产生伤害； Sanger 测序法可以发现外显子区域的变异以及拷贝数的变异, 应用此法, 人们发现了很多重要的突变, 但是Sanger 法通量太低,不能满足大规模检测基因突变的要求。第二代测序(Next generation squencing, NGS) 的出现，开创了高通量测序时代的新纪元。NGS的优势在于：检测范围广，可适用混杂样品和石蜡标本；检测通量大，可实现多个（1-96）样品的并行测序；检测效率高，可同时针对多个突变位点提供基因变异信息；检测特异性强，靶向性针对热点突变区，无Dropout； 检测灵敏度高，可检测突变率低于5%的基因变异【19,

18、20】。总之，NGS的特点为通量高、速度快、成本低, 给检测基因突变带来了革命性的变化，该技术检测基因突变的流程简单, 研究人员运用全基因组从测序, 目标基因组测序以及转录组测序能够实现基因突变的全方位、高准确的检测，为个性化治疗的开展提供了坚实的技术平台。虽然肿瘤的驱动基因突变检测在肺癌、乳腺癌和结直肠癌中已得到广泛应用，在指导临床分子靶向治疗中取得了可靠地进步；有效的提高了疗效，改善了患者的预后。但在头颈部鳞癌中尚未见到相关驱动基因的系统研究报道，尤其是利用二代测序技术对头颈部鳞癌突变基因的检测在国内外仍属空白。因此，本研究拟应用二代测序技术检测已知48个癌相关基因在头颈部鳞癌的突变情况，

19、通过统计学处理筛选与头颈部鳞癌复发和转移相关的基因，建立预测头颈部鳞癌复发和转移风险的数学模型，为个体化治疗提供依据。2研究目的、意义研究目的：筛选头颈部鳞癌复发和转移的相关基因，预测头颈部鳞癌患者复发和转移的风险，开展个体化治疗，有效地提高患者和生存率。研究意义：预测头颈部鳞癌复发和转移风险的数学模型的建立，为头颈部鳞癌的个体化治疗提供分子依据，具有重要的临床应用价值；并为进一步开展针对发现的与转移、复发相关基因的功能研究提供重要线索，为探究头颈部鳞癌的发病机制及靶向治疗提供分子水平的依据。3对本学科发展促进作用及前景头颈部鳞癌是头颈部常见的恶性肿瘤，近年来，虽采用以手术为主综合治疗，但5年

20、生存率难以有效提高。筛选与其复发和转移相关的基因，指导个体化治疗，是临床亟待解决的实际问题。本研究的结果有助于预测头颈部鳞癌复发和转移的风险，通过个体化治疗，提高患者的生存率，具有重要的临床应用价值；同时为进一步探究头颈部鳞癌的发病机制及靶向治疗提供试验依据。（二）研究内容及总体目标1总体目标总体目标：1）应用二代测序技术检测已知癌相关基因在头颈部鳞癌的突变情况； 2）通过统计学处理筛选与头颈部鳞癌复发和转移相关的基因；3）建立预测头颈部鳞癌复发和转移风险的数学模型，为个体化治疗提供依据。2研究内容主要研发内容：1）应用二代测序技术检测200例头颈部鳞癌中已知的48个癌相关基因的突变情况；2）

21、通过统计学处理进行生物信息学分析、聚类分析，分别筛选出与复发和转移相关基因；3）利用筛选出的相关基因建立头颈部鳞癌复发和转移风险的COX数学模型，预测复发和转移的风险，指导个体化治疗。3. 采取的具体技术方法、解决问题方案；3.1标本的收集与分组。 我们回顾了2008年4月至2012年4月在天津医科大学肿瘤医院就诊的头颈部鳞癌患者手术后转移与复发的回访情况,确定研究的入组标准如下:于天津医科大学肿瘤医院颌面耳鼻喉头颈肿瘤科就诊的头颈部鳞癌癌患者且主要治疗在此完成,有完整的临床信息记录,头颈部鳞癌为原发肿瘤,诊断时未发现转移,无其他原发肿瘤,至少24个月随访期,接受手术患者至少6个月术后存活期。

22、依据标准收集天津医科大学附属肿瘤医院头颈部鳞癌手术或者咬检标本和临床资料200例。按照有无复发与转移进行分组。按照是否有转移分成转移组、无转移组。是否复发分为复发组、无复发组。通过两名具有高级职职称的病理科医师进行诊断，并进行TNM分期（参考2010版NCCN癌症指南）；收集头颈部鳞癌患者有关生活习性、职业状态、家族史等在内的流行病学资料数据，并通过调阅天津医科大学附属肿瘤医院统计室随访资料患者预后进行分类； 3.2通过二代测序技术对已知48个癌相关基因突变情况进行检测。1）利用Illumina公司的llumina TruSeq Amplicon Cancer Panel(TSACP)测序试剂

23、盒，针对目前在恶性肿瘤中突变率较高的ABL1, AKT1, ALK, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, MLH1, MPL, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, EGFR, ERBB2, ERBB4, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, RET, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TP53, VHL, GNAS, HNF1A, HRAS, IDH1, JAK2, JAK3, KDR, KIT, CSF1R, GNA11, KRAS, PTPN11, CTNN

24、B1, GNAQ, MET 和RB1等48 基因的突变热点区，利用Illumina公司唯一通过FDA认证的个人二代测序仪MiSeq进行目标靶向捕获测序.通过增加测序深度和提高检测灵敏度保证检测结果的稳定性和准确性，减少假阴性结果；同时利用qPCR对阳性样本或可疑样本进行复检以避免假阳性结果。2）二代测序过程：提取肿瘤组织DNA，利用TSACP中212对特异性扩增引物杂交到基因组DNA上以捕获靶向区域。洗去未结合的探针，通过酶反应对已结合的上下游探针进行延伸以及连接，将产物与标签、接头进行PCR反应，用磁珠纯化、均一化样本文库，最后混合所有样本上机测序。在MiSeq上建立sample sheet

25、，依次将flow cell， PR2 试剂和试剂cartridge放入MiSeq，启动测序。测序结束后利用BWA基因组回帖软件将二代测序原始读段数据（FastQ文件）回帖到参考基因组上（hg19），通过GATK软件对检测到48基因中发生点突变、插入删除突变（小于25个核苷酸片段）的位点进行挖掘，使用Annovar等软件对挖掘到的变异位点进行注释，结合ClinVar软件预测发现的基因变异是否影响蛋白表达和功能。3.3 通过生物信息学处理、聚类分析，筛选头颈部鳞癌复发转移相关基因及有意义的突变点。3.4应用二代测序的检测头颈部鳞癌的驱动基因及主要突变点，并结合临床病理资料，进行统计学分析，利用CO

26、X多因素风险模型，建立转移、复发风险的数学模型。我们使用Kaplan-Meier分析来统计研究各种驱动基因状态等影响因子对复发与转移进展时间的影响;时序检验(log rank test)用于两组间简单比较;用卡方检验来统计分析各种驱动基因突变与临床因子的关系。在统计分析头颈部鳞癌的危险因素时,我们先使用单因素COX比例风险模型(univariate Cox proportional hazard model)从假设因子(包括各驱动基因突变,性别、诊断头颈部鳞癌时的年龄、头颈部鳞癌的组织学类型、原发灶的位置、吸烟史、诊断时的肿瘤分期和淋巴结转移情况等临床因子)中计算出与转移和复发相关的因子(P0

27、.1),Wald分析(Waldstatistics )用于评估统计学意义;我们再用多因素COX比例风险回归8(multivariate Cox proportional hazards regression model)模型联合分析单因素cox比例风险模型得出的相关因子,从中得出转移与复发的危险因子,当P值0.05时认为统计有意义。然后我们把这些有统计意义的转移和复发的风险因子建立成一个转移与复发的预测模型。我们利用多因素COX比例风险模型得出的偏回归系数来定义一个转移与复发的风险预测积分,按积分多少进行危险度分组,最终区分出头颈部鳞癌中转移与复发的高、中、低危人群。上述统计分析均为两侧,P0

28、. 05认为有统计学意义。所有统计借助SPSS 18.0统计软件完成。技术路线图:（三）项目可行性分析1，前期工作情况及基础（1）我们前期通过对头颈部鳞癌标本中VHL的检测发现头颈部鳞癌中存在VHL的低表达，且表达程度与肿瘤分化、转移、耐药及复发有关，在舌鳞癌细胞系中检测到EGFR、VHL的表达。如我们前期对VHL的研究发现，VHL表达缺失与肿瘤的转移、预后、EMT密切有关，重新表达VHL后，有一个细胞形态学发生明显变化，肿瘤发生迁移，增殖，侵袭和EMT的能力都被抑制，Snail,、N-cadherin、MMP-2/9、HIF-1a and VEGF 的表达被下调，而E-cadherin的表达

29、上调，.如图1,2。以上实验结果表明VHL与头颈部鳞状细胞癌EMT发生过程密切相关。HIF-1a是一个重要的VHL调控的下游基因，此外，在此次实验过程中，发现-连环蛋白也可能是一个重要的VHL调控的下游基因，其可能会诱发口腔癌EMT的过程【11】。而对CXCR4的研究发现淋巴结转移中CXCR4的表达高于非淋巴结转移组,且CXCR4与Twist、Snail及N-cadherin的表达呈正相关,而与P-catenin呈负相关（如图3），发现CXCR4 SiRNA具有诱导舌癌细胞调亡、抑制经典Wnt通路参与舌癌EMT发生（如图4,5）,从而抑制舌癌细胞侵袭转移的能力，CXCR4可成为抑制口腔鳞癌EM

30、T发生的有效靶点【12】。图1，VHL和EMT相关蛋白表达在各组淋巴结转移（LN+）和非淋巴结转移（LN）和VHL与相关患者的总生存期。（一）免疫组化结果显示VHL基因阳性被发现在细胞质和细胞核，LN（）组表现出较强的表达。 -catenin的增加 细胞核和细胞质中LN（+）。蜗牛和HIF-1表现出更强的核和细胞质LN表达（+）组。 N-cadherin的阳性染色明显在LN（+）组，设在与细胞膜和细胞浆。 E-cadherin蛋白定位于细胞膜和LN表达强（）。 MMP-2/9显示了较强的染色细胞质中LN（+）（400倍）。（B）中的存活曲线患者的口腔鳞状细胞癌，患者VHL高表达有较好的预后。

31、P 0.05图2 VHL的表达恢复受影响的相关蛋白的表达。 （a）若检测-连环蛋白的转染与VHL后。 （B）B-连环蛋白表达降低两细胞质和细胞核中。（三）检测转染与VHL通过Western blot后Tscca和Tca8113P160细胞相对蛋白质。 -连环蛋白，蜗牛，N-钙粘蛋白，HIF-1， VEGF和MMP2/9被下调，E-cadherin蛋白水平上调。 * P 0.05图3，免疫组化方法检测CXCR4, -catenin及EMT相关因子Twist、Snail、N-cadherin在口腔麟癌中的表达。图4，经IHC检测发现,与Control及Scramble组相比,si CXCR4组中,

32、MMP-9,MMP-2及N-cadhrein表达水平明显降低,而E-cadherin的表达升高。图5 western blot检测经典Wnt通路蛋白表达情况。（2） 实践的可行性：本研究使用的技术手段包括：细胞生物学的评价手段、组织病理学检测等均为经典方法，并有自身多年实践基础。在天津医科大学肿瘤医院肿瘤组织库的组织库的支持下，按照天津医科大学人的医学伦理审查要求，收集了近百例头颈鳞癌手术标本，为研究进一步开展实施打下基础,。依托天津医科大学肿瘤医院二代测序平台，有着充分的设备和技术保障。（3） 课题组成员的经历与经验：申请者及其研究团队多年来长期从事头颈部鳞癌转移机制及靶向治疗的研究，承担多

33、项教委及科委课题，积累了丰富的经验，熟练掌握分子生物学的各项实验技术。所在的头颈外科，每年完成头颈部鳞癌手术患者300余例，临床标本丰富，能够满足课题的需要。与天津市肿瘤防治重点实验室有良好的合作关系、可以保证二代测序的顺利完成。 2项目的知识产权情况：不存在知识产权争议3项目负责人及主要研发人员简介；姓名：王旭东主要学历：1986-1991年就读于天津医科大学医学系并获医学学士学位；1997-2000肿瘤学专业头颈肿瘤学方向硕士研究生获得医学硕士学位；2002-2005年师从著名肿瘤学专家郝希山院士攻读肿瘤学博士研究生并获医学博士学位；2009-2010年分别在美国MD.Anderson c

34、ancer center、Karmanos cancer center开展访问学者工作。研究工作简历：承担天津市应用基础与前沿技术研究计划（项目编号：JCYBJC33800）在研；承担天津市高等学校科技发展基金项目（项目编号：20050222），已结题；参与新编头颈肿瘤学、简明肿瘤学、肿瘤手术学等多部专业论著编写主要论著及出处：（1） Shu Zhang, Xuan Zhou, Bo Wang, Kailiang Zhang, Su Liu, Kai Yue, Lun Zhang, Xu dong Wang. a Loss of VHL expression contributes to ep

35、ithelialmesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma. oraloncology.2014.06.07：1368-8375（2）张舒，王博，周旋，岳恺，王旭东(通讯作者).趋划因子CXC亚家族受体调控口腔鳞状细胞癌上皮间质转化介导淋巴转移的体外实验. 中华口腔医学杂志 2014,49(3):（3） Bo Wang, Kai Yue, Xu-dong Wang et al. The recurrence and survival of oral squamous cell carcinoma: a report of 275

36、 cases J. Chin J Cancer, 2013 Nov;32(11):614-8（4） 王博，张舒，王旭东(通讯作者).等。EMT介导口腔鳞癌淋巴转移及其机制研究J。中国肿瘤临床，2012，23（39）：1877-1885。（5）吴延升,董俊峰,岳恺,曹晓莉,王旭东(通讯作者). CXCL12/CXCR4生物学轴与甲状腺乳头状癌淋巴结转移的相关性研究.中国肿瘤临床,2011,38(23):1439-1442姓名：吴延升主要学历：本人自于2000-2005年就读于锦州医学院本科并获得医学学士学位；2005年起于天津医科大学攻读肿瘤专业硕士研究生，于2008年获得医学硕士学位。2008

37、年起至今就职于天津医科大学附属肿瘤医院颌面耳鼻咽喉颈部肿瘤科，现师从我国著名肿瘤学家郝希山院士攻读肿瘤学博士。研究工作简历：硕士在学期间参与天津市高等学校科技发展基金项目胞内捕获趋化因子受体抑制甲状腺乳头状癌转移的研究（项目编号：20050222）。主要论著及出处：（1）吴延升，张丽，赵景会，张仑，王旭东，舌鳞状细胞癌预后多因素分析，实用肿瘤杂志，2012，27（2）：136-139（2）吴延升,董俊峰,岳恺,曹晓莉,王旭东(通讯作者). CXCL12/CXCR4生物学轴与甲状腺乳头状癌淋巴结转移的相关性研究.中国肿瘤临床,2011,38(23):1439-1442（3）曹晓莉,张文超, 吴延

38、升,岳恺,王旭东(通讯作者).CXCL12/CXCR4生物轴在头颈部鳞癌淋巴转移的作用. 中华实验外科杂志,2010,27(7):992-994姓名：岳恺主要学历：2003-2011年就读于天津医科大学七年制获医学硕士学位，2011年起至今就职于天津医科大学附属肿瘤医院颌面耳鼻咽喉颈部肿瘤科研究工作简历：主要研究方向为头颈部鳞状细胞癌转移与上皮间质转化的关系与机制主要论著及出处：（1） CXCL12-KDEL融合基因绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定.中国肿瘤临床，2010，37（10），550-3（2） 179例全喉切除患者生活质量分析.2011国际暨全国第十一届头颈肿瘤学术大会论文汇编姓名：

39、刘速主要学历：2007年-2012年就读于南华大学医学院并获得医学学士学位；自2010年起至今就读于天津医科大学研究生院攻读肿瘤学方向硕士研究生。研究工作简历：主要研究方向为头颈部鳞状细胞癌转移与上皮间质转化的关系与机制姓名：何清华主要学历：2008年-2013年就读于潍坊医学院并获得医学学士学位；自2012年起至今就读于天津医科大学研究生院攻读肿瘤学方向硕士研究生。研究工作简历：主要研究方向为头颈部鳞状细胞癌转移与上皮间质转化的关系与机制姓名：段远胜主要学历：2008年-2013年就读于潍坊医学院并获得医学学士学位；自2010年起至今就读于天津医科大学研究生院攻读肿瘤学方向硕士研究生。研究工

40、作简历：主要研究方向为头颈部鳞状细胞癌转移与上皮间质转化的关系与机制4已具备的优势和不足。课题申请者本人熟悉当前头颈部鳞癌分子病理和分子生物学发展前沿研究内容，近年来已经形成了由多人组成的专门从事头颈肿瘤细胞生物学和分子生物学研究的课题组。可熟练掌握分子生物学常用实验技术。自创建以来在包括肿瘤应用基础研究在内的基础医学领域多次获得国家自然基金的资助，均能按期、按计划完成；申请人依托天津医科大学肿瘤医院、天津市肿瘤防治重点实验室、二代测序平台，与其形成了良好的工作关系；申请人所在医院，每年能完成头颈部鳞癌手术患者300余例，能保证本课题临床部分内容的顺利完成。本课题组成员中大部分为年轻的博士和在

41、读硕士研究生，在二代测序技术的学习和掌握上难度较大，但经过学习培训可以完成研究内容。（四）主要技术及效益指标1项目的技术指标；总体目标：1）应用二代测序技术检测已知癌相关基因在头颈部鳞癌的突变情况； 2）通过统计学处理筛选与头颈部鳞癌复发和转移相关的基因；3）建立预测头颈部鳞癌复发和转移风险的数学模型，为个体化治疗提供依据。2项目完成后的预期效益：头颈部鳞癌复发和转移风险的COX数学模型的建立，可有效地预测肿瘤复发和转移的风险，更为精确地评估预后并指导个体化治疗，具有良好的临床应用价值和社会效益。所筛选出的与复发和转移相关的基因，为进一步探究头颈部鳞癌的复发和转移机制及靶向治疗提供依据，为后续

42、深入开展针对发现的癌相关基因的下游调控功能研究提供重要线索；有助于阐明头颈部鳞癌复发和转移的分子机理并制定相对应的防治策略。3不确定性分析，风险因素分析和对策；本研究使用二代测序技术为新一代分子检测技术，主要存在以下技术风险：1）标本的切放和存留；2）技术方法操作；3)生物信息学分析和数学模型的建立。解决方法：1），病理诊断肿瘤组织并进行分类，快速送检；2），向二代测序技术人员交流学习；3）请教专业机构进行生物信息学分析并与其合作。收集完善规范的临床资料，请统计学专家辅导建立数学模型。 4考核指标研究项目结题应满足以下条件之一：1)发表论文4篇，其中SCI收录两篇；2)建立评估头颈部鳞癌复发转

43、移风险的数学模型；3)开展临床试验一项；（五）实施的分阶段目标和年度进展计划1项目分阶段目标以及年度进展计划；2014.08-2015.02：收集天津医科大学附属肿瘤医院头颈部鳞癌临床病例资料，进行分类。2015.02-2015.08：根据所收集临床病例资料，收集天津医科大学附属肿瘤医院组织标本库中头颈部鳞癌手术或者咬检标本。2015.08-2016.02：应用二代测序技术检测200例头颈部鳞癌标本中48个已知癌相关基因的突变情况。2016.02-2016.08：对检测结果进行聚类分析，分别筛选出与复发和转移相关基因；利用筛选出的相关基因建立头颈部鳞癌复发和转移风险的COX数学模型。2016.

44、08-2017.02：完成实验研究临床资料数据分析与总结，撰写研究论文并投稿2017.02-2017.08: 汇总整体实验研究结果，对实验过程中发现的兴趣点进行后续研究2项目实施的保障措施；申请人所在单位为天津医科大学肿瘤医院，病人资源丰富，每年能完成头颈手术患者3000余例，能保证本课题临床部分内容的顺利完成。天津医科大学肿瘤医院建立的二代测序技术拥有先进的硬件基础，充足的技术储备，本课题组与其具有良好的协作关系。此外，天津医科大学肿瘤医院拥有能够开展蛋白组学、功能基因组学、细胞生物学、生物信息学及生物芯片等研究的技术平台。课题申请者本人熟悉当前头颈部恶性肿瘤分子病理和分子生物学发前沿研究内

45、容，具有一定设计和协调完成重大课题研究的经验，已经熟练掌握分子生物学常用实验技术。参考文献：【1】lay J，Shin HR，Bray F，et a1Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008l J IInt J Cancer，2010，127(12)：2893-2917. 【2】 Posner M, Vermorken JB. Induction therapy in the modern era of combined-modality therapy for locally advanced head and neck cancer. Semin Oncol. 2008, 35:221-8.【3】Zhang L, Zhou X, Yao X, Wu Y, Zhang Q, Zhang L. Oral tongue cancer patients show a better overall survival t