细胞生物学提要.ppt
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1、细胞生物学,学习提要,“细胞学说”的基本内容, 认为细胞是有机体,一切动植物都是由细胞 发育而来,并由细胞和细胞产物所构成; 每个细胞作为一个相对独立的单位,既有它“自己的”生命,又对机体整体的生命有所助益; 新的细胞只能通过细胞分裂产生。,细胞是生命活动的基本单位,细胞是构成有机体的基本单位 细胞具有独立的、有序的自控代谢体系, 细胞是代谢与功能的基本单位 细胞是有机体生长与发育的基础 细胞是遗传的基本单位,细胞具有遗传的全能性 没有细胞就没有完整的生命,细胞的基本共性,由脂蛋白体系的生物膜; DNARNA遗传装置; 蛋白质合成的机器核糖体 一分为二的方式进行分裂,原 核 细 胞(proka
2、ryotic cell),最基本的特点: 基因组遗传信息量小,一个环状DNA 细胞内没有膜相结构,没有专门的细胞器和细胞核; 主要代表: 支原体(mycoplast)最小最简单的细胞; 细菌 蓝藻(又称蓝细菌)(Cyanobacteria),最小、最简单的细胞支原体,支原体(mycoplast)0.10.3m,仅为细菌的十分之一 具有细胞的特征: 能在培养基上生长 具有典型的细胞膜 一个环状的DNA mRNA和核糖体 一分为二的分裂繁殖方式,真核细胞(eukaryotic cell)结构体系,生物膜 结构系统,遗传信息 表达系统,细胞骨架 系统,原核细胞与真核细胞的主要差异,植物细胞与动物细胞
3、的比较,细胞壁 液泡 叶绿体,细胞形态结构的观察方法,光学显微镜技术(LM) 电子显微镜技术 ( EM):TEMSEM 扫描遂道显微镜 (STM),几种显微镜观察样品大小的范围,1cm 1mm 100um 10um 1um 100nm 10nm 1nm 0.1nm,光学显微镜,电子显微镜,扫描隧道显微镜,普通复式光学显微镜技术,分辨率(D)是指区分开两个质点间的最小距离 决定LM分辨率的三要素 物镜镜口角() 入射光波长() 界质折射率(N),荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy),荧光显微镜的应用 不同的荧光染料激发后可发出不同的荧光,可用不同的荧光剂对同一标本染色
4、,使细胞的不同成分呈现不同的颜色; 在光镜水平用于特异蛋白质的定性和定位;如绿色荧光蛋白(GFP)的应用,光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位的最有力工具,光学显微镜与电子显微镜的基本区别,电镜的限制:不能观察活的生物样品;难以观察细胞的全貌;,主要电镜制样技术,超薄切片技术 用于电镜观察的基本样本制备 负染色技术 染色背景,衬托出样品的精细结构 冰冻蚀刻技术 冰冻断裂与蚀刻复型: 主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构 快速冷冻深度蚀刻技术(quick freeze deep etching) 电镜三维重构技术:电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合,扫描电镜,样品处理 CO
5、2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力 喷镀一层金膜表面良好的导电性。,扫描隧道显微镜 STM (scanning tunnel microscope),原理:量子力学中的“隧道效应”。其关键部件是一个加上一定电压的精密探针。探针接近物质时,因“隧道效应”而飞出电子,从而产生电流;当表面原子凸凹不平,使探针与物质表面间的距离不断发生改变,电流因而随之变化。,扫描隧道显微镜,特点 分辨本领高,(横向分辨率为0.10.2nm, 纵分辨率可达0.001nm); 可在真空、大气、液体等多种条件下工作; 非破坏性测量。 用途 可直接观察生物大分子的原子布阵和一些生物结构的原子排列。纳米生物学研究领域中
6、的重要工具 。,差速离心,特点 介质密度均一;速度由低向高,逐级离心。 沉降顺序 核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。 用途 分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。可将细胞器初步分离,常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。,密度梯度离心,各种成分的沉降速率与它们的形状和大小有关, 通常以沉降系数(S)表示。 类型:速度沉降、等密度沉降。 常用介质:氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。,速度沉降,特点 介质密度较低,介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 原理 介质密度梯度平缓,分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。,等密度沉降,特点 介质密度高,陡度大,介质最高密度大于被分
7、离组分的最大密度。 力场比速率沉降法大10100倍,需要高速或超速离心。 原理 样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处,并停留在那里达到平衡,从而将不同密度的成分分离。,常用细胞化学方法,流式细胞仪,细胞分散并对待测成分进行特异染色; 悬滴中的细胞一个一个依次通过检测器; 检测器可测定每个细胞中待测成分的含量; 不同表面标记的细胞所带电荷情况不同产生不同偏转,实现细胞的分选。,基本概念,原代培养(primary culture):指直接从机体,特别是幼小动物机体取出的细胞进行的培养,一般指传代10代以内的培养物。 传代培养(subculture):是指细胞
8、从一个培养瓶以一定比例转移接种到另一培养瓶的培养。,基本概念,细胞株(cell strain):从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。 细胞系(cell line):来源于原代培养物,在培养过程中发生突变或转化的细胞,在培养条件下可无限传代的细胞。 克隆(clone):亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。,植物细胞培养,原生质体培养 培养脱壁后的细胞 单倍体培养 通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。,细胞融合(cell fusion) 通过培养和介导,两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞,同核体:相同基因型的细胞融合而成。 异核体:不同基因型的细胞
9、融合而成。 自发融合:同种细胞在培养过程中自发合并的现象。 诱发融合:异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。 融合因子:生物方法(灭活的病毒)、 化学方法(PEG)、 物理方法(电击和激光)。,单克隆抗体技术,原理: B淋巴细胞能分泌特异抗体,但不能长期培养,瘤细胞可以在体外长期培养,但不能分泌特异抗体。于是Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术,获1984年诺贝尔奖。,Preparation of hybridomas that secrete monoclonal antibodies against a particular antigen (X).
10、 The selective growth medium used contains an inhibitor (aminopterin) that blocks the normal biosynthetic pathways by which nucleotides are made. The cells must therefore use a bypass pathway to synthesize their nucleic acids, and this pathway is defective in the mutant cell line to which the normal
11、 B lymphocytes are fused. Because neither cell type used for the initial fusion can grow on its own, only the hybrid cells survive.,Monoclonal Antibodies,HAT培养基,HAT培养基 次黄嘌呤(hypoxantin) 氨基蝶呤(aminopterin) 胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin) 细胞内核苷酸的合成有从头合成途径和扑救途径。由于氨基蝶呤可阻碍起始合成途径,所以培养基中含有它时,细胞便只能依赖补救途径 。 嘌呤的中间合成途径缺失株(HG
12、PRT-)和嘧啶的中间合成途径缺失株(TK-),由于可以互补,所以两者的杂种细胞,即使在氨基蝶呤的存在条件下也可以增殖。,模式生物的意义,由于基因在进化上的保守性和遗传密码的通用性,从一种实验生物得到的有关基因性质或功能方面的信息往往也适用于其它生物,因此我们有可能选择更适于回答细胞生物学问题的模式生物进行研究。,模式生物的特点,个体较小; 容易培养; 操作简单; 生长繁殖快;,细胞质膜(plasma membrane) 又称细胞膜(cell membrane):是指围绕在细胞最外围,由脂质和蛋白质组成的生物膜 生物膜(biomembrane) 细胞内的膜系统与细胞膜统称为生物膜,质膜主要结构
13、模型,(a)Davson和Danielli 双分子片层模型(1935) (b)Singer和G.Nicolson 流动镶嵌模型 (1972) (c)目前盛行的膜的结构模型,目前对生物膜结构的认识,组织者膜脂 功能执行者膜蛋白 膜脂与膜蛋白的相互作用,特性:双极性分子 结构:脂质双分子层,膜的成分膜脂,磷脂 甘油磷脂 鞘磷脂 糖脂 胆固醇,脂质体(liposome)根据磷脂分子可在水相中形成稳定的脂双层膜的趋势而制备的人工膜。,膜的成分膜蛋白,膜内在蛋白(整合膜蛋白) 膜外在蛋白(膜周边蛋白) 脂锚定膜蛋白,u离子型去垢剂 (SDS) u非离子型去垢剂(Triton X-100),去垢剂两性小分
14、子,是分离与研究膜蛋白的常用试剂。,膜的流动性,膜脂流动性 脂肪酸长度、饱和度; 温度; 胆固醇的双重调控; 膜蛋白流动性,膜蛋白的流动性,荧光抗体免疫标记实验 成斑现象(patching)和成帽现象(capping) 荧光漂白恢复技术(光脱色恢复技术FRAP),膜的不对称性,细胞膜各部分名称,ES,EF,PF,PS,膜骨架,膜骨架(membrane associated cytoskeleton)是质膜下与膜蛋白相连的纤维蛋白组成的网架结构。 血影(ghost) 红细胞经低渗处理,细胞破裂释放出内容物,留下一个保持原形的空壳,脂双层的不透性和膜转运蛋白,膜转运蛋白 载体蛋白(carrier
15、protein) 通道蛋白( carrier protein ),载体蛋白及其功能,特异性 构象变化 通透酶(permease):饱和性和竞争性 介导被动运输与主动运输。,跨膜的亲水性通道离子通道 离子选择性,可调节性 只介导被动运输 离子通道与载体蛋白区别: 极高的转运效率 没有饱和值 门控通道,通道蛋白及其功能,电压门通道 配体门通道 压力激活通道,配体门控通道(ligand gated channel),特点:受体与细胞外的配体结合,引起通道蛋白发生构象变化“门”打开,又称离子通道型受体。 分类: 阳离子通道,如乙酰胆碱、谷氨酸和五羟色胺受体, 阴离子通道,如甘氨酸和氨基丁酸受体。,电位
16、门通道(voltage gated channel),特点 细胞内或细胞外特异离子浓度或电位发生变化构象变化“门”打开 Na+、K+、Ca2+三种电压门通道结构相似,在进化上是由同一个远祖基因演化而来。,被动运输与主动运输,被动运输的特点 运输方向(高浓度低浓度) 跨膜动力(电化学梯度) 膜转运蛋白(通道蛋白、载体蛋白),简单扩散(simple diffusion),自由扩散(free diffusion) 特点 沿浓度梯度(或电化学梯度)扩散 不需要提供代谢能 没有膜蛋白的协助 物质的通透率 取决于分子大小和分子的极性,协助扩散(facilitated diffusion) (促进扩散、易化
17、扩散),特点 转运速率高 特异性 饱和性,主动运输(active transport),由载体蛋白所介导的物质逆浓度梯度或电化学梯度进行跨膜转运的方式 特点 能量必须与细胞内某种释放能量的过程相偶联 载体蛋白构象变化,影响亲和力的改变,ATP驱动泵:ATP酶 偶联转运蛋白 (协同转运) 光驱动泵,ATP驱动离子泵,P型离子泵 V型质子泵 F型质子泵 ABC超家族,P型离子泵-钠钾泵(Na-kATPase),结构 亚基、亚基 机制 Na依赖的磷酸化 k依赖的去磷酸化 意义质膜两侧Na、k不均匀分布 有助于维持动物细胞的渗透平衡; 胞外高浓度的Na代表了大量的能量储存;驱动转运溶质进入细胞;,P-
18、型质子泵-钙泵(Ca2ATPase),分布:细胞膜和内质网膜上 意义:维持胞质低钙离子浓度,P-型质子泵(HATPase),植物细胞、细菌、真菌(包括酵母)的 质膜上 建立和维持H梯度。 哺乳类胃的泌酸细胞质膜上 将H泵出 ,将K 泵进。,V-型质子泵和F-型质子泵,共同点 只转运质子;不发生自磷酸化 V-type 膜泡质子泵(vacuolar proton pump) 存在于各类小泡膜上 水解ATP 逆浓度转运H到细胞器内,维持细胞器内酸性 F-type 利用质子动力势合成ATP,也叫H ATP合成酶 分布于线粒体内膜、植物细胞类囊体膜、细菌质膜,协同转运(cotransport),协同转运
19、是由Na+-K+泵(或H+-泵)与载体蛋白协同作用, 靠间接消耗ATP所完成的主动运输方式 能量来源膜两侧离子的电化学浓度梯度 动物细胞中常常利用膜两侧Na+浓度梯度来驱动。 植物细胞和细菌常利用H+浓度梯度来驱动。 分类 同向运输(symport) 对向运输(antiport),胞吞作用和胞吐作用,膜泡运输 大分子与颗粒性物质的 跨膜主动运输,胞饮作用与吞噬作用主要有三点区别,受体介导的胞吞作用,批量内吞和受体介导的内吞 受体介导的内吞作用 选择浓缩机制 低密脂蛋白、运铁蛋白、生长因子、胰岛素等蛋白类激素、糖蛋白等,都是通过受体介导的内吞作用进行的。,分选机制 分选信号存在于蛋白本身,分选主
20、要由高尔基体TGN上的受体类蛋白来决定 转运途径 粗面内质网高尔基体分泌泡细胞表面,胞吐作用,胞吐作用的类型,组成型胞吐作用 所有真核细胞 意义:质膜更新;胞外基质成分;营养成分或信号分子 连续分泌过程 调节型胞吐作用 特化的分泌细胞 意义:产生的分泌物(如激素、粘液或消化酶) 储存刺激释放,线粒体的超微结构,两层单位膜套叠而成的囊状结构(外膜57nm;内膜6nm); 外膜 内膜 膜间隙 内室 嵴 基本微粒(基粒),电子传递链(呼吸链) electrontransport chain,定义 线粒体内膜上有序排列的有关氧化磷酸化的脂蛋白复合物,由一系列可逆地接受和释放电子或H的成分组成。 2条呼
21、吸链 长呼吸链,即NADH呼吸链; 短呼吸链,即FADH2呼吸链; 组成: 4个功能复合物:包埋于线粒体内膜中; Co.QcytC:可流动的递氢体和递电子体。,ATP合成酶的分子结构与组成,ATP合成酶广泛存在于线粒体、叶绿体、异养菌和光合细菌中,是生物体能量转换的核心酶。 ATP合成酶一般分布在线粒体内膜、类囊体膜或质膜上; 功能氧化磷酸化和光合磷酸化,在跨膜质子动力势的推动下催化合成ATP。 ATP合成酶是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化偶联的关键装置,也是合成能源物质ATP的关键装置。,ATP合成酶,头(F1因子,F1ATPase) 由5种多肽组成33复合体 具有三个ATP合成的催化位
22、点(每个亚基具有一个)。 柄部(寡霉素敏感性蛋白) 基片(F0因子) 三种多肽组成ab2c12复合体,嵌入内膜 12个c亚基组成一个环形结构,具有质子通道。,氧化磷酸化作用与电子传递的偶联,氧化磷酸化 当电子从NADH或FADH2经呼吸链传递给氧形成水时,同时伴有ADP磷酸化形成ATP的过程。 呼吸链上有3个部位的自由能变化较大,是呼吸链中氧化还原释放能量并与ADP磷酸化生成ATP偶联的部位。 NADH辅酶Q; 细胞色素b细胞色素c; 细胞色素aa3分子氧。,氧化磷酸化的偶联机制,化学渗透假说的主要内容: 呼吸链各组分不对称分布,电子在膜中沿呼吸链传递时,所释放的能量将H从线粒体基质侧泵到膜间
23、隙,产生质子梯度,即质子动力势,在此梯度驱动下, H穿过内膜上的ATP合成酶流回基质,其能量促使ADP和Pi合成ATP。,化学渗透假说的特点,强调线粒体膜结构的完整性 保证质子动力势的形成。 解偶联剂的作用机制部分在于改变膜对H的通透性。 定向的化学反应 H定向从基质到膜间隙,形成梯度; H从膜间隙通过ATP合成酶;,ATP合成酶的作用机制,1979年Boyer P提出构象耦联假说。其要点如下: 1ATP酶利用质子动力势,发生构象变化,改变与底物的亲和力,催化ADP与Pi形成ATP。 2F1具有三个催化位点,在特定的时间,三个催化位点的构象不同(L、T、O),与核苷酸的亲和力不同。 3质子通过
24、F0时,引起c亚基构成的环旋转,从而带动亚基旋转,由于亚基的端部是高度不对称的,它的旋转引起亚基3个催化位点构象的周期性变化(L、T、O),不断将ADP和Pi加合在一起,形成ATP。,质体,植物细胞具有独特的细胞器 叶绿体(chloroplast) 有色体(chromoplast) 白色体 (leucoplast),叶绿体的结构,由3部分组成: 外被(chloroplast envelope) 类囊体(thylakoid) 基质(stroma) 含有3种不同的膜:外膜、内膜、类囊体膜 3种彼此分开的腔:膜间隙、基质和类囊体腔,叶绿体基质中,由单位膜封闭形成的扁平小囊。 基粒类囊体:类囊体片层垛
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