细胞表面分子的检测与分析.ppt
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1、本次实验课流程,课件讲述 40min 实验演示 20min 流式细胞仪硬件及软件介绍 30min 上机检测 40min 解惑答疑 15min,医学结构生物学研究中心 柳卫凰,细胞表面分子的检测与分析,流式在细胞表面分子检测中的应用,免疫细胞及其亚群的检测与功能分析 例如:T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞等 血液系统细胞表面标志的研究 例如:急性白血病的初步诊断与检测、CD34+造血干细胞研究、 血小板分析辅助诊断相关疾病等 细胞群体及细胞表面标志变化的监测 例如:测定因试验或临床治疗引起的某些细胞表面标志的变化 细胞表面标志构成性质的分析 例如:蛋白、糖蛋白、类脂结构、性质、比例的分析,标本
2、来源,外周血 全血溶血、PBMC 骨髓穿刺液 体液、灌洗液 实体组织 新鲜组织、石蜡包埋样本 培养的细胞 原代细胞 细胞系:贴壁细胞、悬浮细胞,一、新鲜实体组织样本的制备 酶消化法。 常用的酶类试剂:胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶等 机械法。1、剪碎法 2、网搓法 3、研磨法 化学处理法。 常用试剂:0.2%EDTA 0.25%胰酶+0.2%EDTA 注意:除消化过程外,其余步骤最好在4度环境下操作,提高 细胞活性。,标本制备,标本制备,二、全血标本的制备 “ABC”溶血(Beckman) 取肝素钠抗凝的外周血100ul,荧光标记完成后,依次 加入A液600ul,轻轻振荡15s;B
3、液260ul, 轻轻振荡15s; C液100ul, 振荡10s,免洗上机检测。 “ACK”溶血(自配) 以1:3的比例取肝素钠抗凝的外周血与ACK溶血剂混 匀,室温放置10min,离心去上清,再加入溶血剂溶血,反 复23次,至红细胞完全溶解。细胞重悬后,再进行荧光标 记。,标本制备,三、外周血单个核细胞的制备 (1)取外周血2ml,肝素抗凝,生理盐水稀释成4ml,混匀; (2)沿试管壁缓缓加入4ml淋巴细胞分离液Ficoll,勿用力过大; (3)离心2000r/min,20min,离心后分层,上层为血浆层,中层 为分离液层,底层为红细胞层; (4)用吸管将上层与中层之间的单个核细胞层吸出,用生
4、理盐水 洗两遍,PBS重悬; (5)荧光标记。,四、贴壁细胞单细胞悬液的制备 (1)将培养细胞用0.04EDTA或0.25胰酶消化37分钟, 至光镜下见到贴壁细胞变圆还没有漂浮为止,弃消化 液,加PBS; (2)用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来,移入离心管中; (3)离心,1000r/min,5min; (4)加PBS洗两遍; (5)PBS重悬,将细胞吹打均匀; (6)荧光标记。,标本制备,标记方法,直接免疫荧光法 特点:操作简单、省时;特异性强;结果判断较简单。 间接免疫荧光法 特点:适用范围广;抗体相对便宜;操作费时;易产生非特异性染色,结果不易判断。(建议只用于单标检测) 直接、间接混合
5、染色法 染色原则:一般情况下先间接后直接,特殊情况下可先直 接标记。,推荐!,对照设置,阴性对照 调节荧光探测器放大倍数,确定带测标本的基础荧光域值。常用的有:同型对照、封闭抗体对照、阴性细胞对照 阳性对照 检测抗体特异性或确定实验方法的稳定性、准确性。 空白对照 确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。 补偿对照 多色荧光标记时,用于荧光光谱重叠的调节。,同型对照(Isotype Control),用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色 与染色的单克隆抗体 相同种属来源 相同免疫球蛋白及亚型 相同荧光素标记 相同剂量和浓度 由未免疫动物血清纯化而来,双色标
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