山羊褪黑激素受体A基因HinfⅠ酶切多态及其与产羔数状的关联分析本科.doc
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1、华中农业大学本科毕业论文(或设计) 1 本科毕业论文本科毕业论文 题题 目:目: 山羊褪黑激素受体山羊褪黑激素受体 1A1A 基因基因HinHinff酶切酶切 多态性及其与产羔数性状的关联分析多态性及其与产羔数性状的关联分析 姓姓 名:名:学学 号号 专专 业:业: 动动 物物 科科 学学 指导教师:指导教师:职职 称称 华中农业大学本科毕业论文(或设计) 2 分类号 密级 华华中中农农业业大大学学本本科科毕毕业业论论文文 山羊褪黑激素受体山羊褪黑激素受体 1A1A 基因基因HinHinff酶切多态性及其与酶切多态性及其与 产羔数性状的关联分析产羔数性状的关联分析 Hinf-RFLP of M
2、elatonin receptor 1 A(MTNR1A) gene and the association with the litter size traits in goat 华中农业大学本科毕业论文(或设计) 3 目 录 摘 要.4 ABSTRACT5 前 言.6 1.材料与方法7 1.1 材料.7 1.1.1 试验动物7 1.1.2 实验材料7 1.1.3 主要试剂的来源 7 1.1.4 主要仪器设备 8 1.1.5 主要试剂的配置 8 1.1.6 主要分子生物学软件 .10 1.2 方法10 1.2.1.山羊基因组 DNA 的提取.10 1.2.2.引物设计及其序列.10 1.2.
3、3.PCR 扩增及其电泳检测 .11 1.2.4. 限制性内切酶消化扩增产物以及电泳检测.13 1.2.5.统计分析.14 2 结果与分析15 2.1 PCR 扩增结果 .15 2.2 酶切结果 .15 2.3 褪黑激素基因频率和基因型频率分析结果.16 2.4 MTNR1A 基因型与波尔山羊头胎产羔数性状的关联分析 17 2.5 MTNR1A 基因型与经产产羔数性状的关联分析 17 3 讨论18 31 不同山羊品种基因型频率及基因频率差异18 32 MTNR1A 不同基因型对波尔山羊头胎和经产羔数的影响 .18 参考文献.19 致 谢20 华中农业大学本科毕业论文(或设计) 4 山羊褪黑激素
4、受体山羊褪黑激素受体 1A1A 基因基因HinHinff酶切多态性及其与产羔数酶切多态性及其与产羔数 性状的关联分析性状的关联分析 摘摘 要要 本研究以褪黑激素受体 1A 基因为候选基因,分析该基因多态性对山羊产 羔数性状的影响。采用限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length polymorphism, PCR-RFLP)方法,检测了 65 只波尔山羊和 51 马头山羊褪黑 激素受体 1A 基因 Hinf酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析。结果表明, 褪黑激素受体 1A 基因在波尔山羊中存在 Hinf酶切多态性,而在马头山羊样 本中则无多态性。在波尔山羊中,
5、检测到 AA、GG 两种基因型,未检测到 AG 型;其中 AA 基因型个体在出现频率最高,为 0.554,GG 型为 0.446;A、G 等 位基因频率分别为 0.554 和 0.446。性状关联分析结果表明:波尔山羊的 AA 基 因纯合型头胎平均产羔数比 GG 基因杂合型多 0.07 只,加性效应值为 0.035, 显性效应值为-1.42;经产羔数的 AA 型比 GG 型多 0.09 只;加性效应值为 0.046,显性效应值为-1.84。A 等位基因可能与波尔山羊产羔数呈正相关,该 位点主要以加性方式起作用。 关键词关键词:山羊;繁殖性状;褪黑激素受体;PCRRFLP 华中农业大学本科毕业论
6、文(或设计) 5 Hinf-RFLP of Melatonin receptor 1 A(MTNR1A) gene and the association with the litter size traits in goat Abstract In the present study, Melatonin receptor 1 A gene (MTNR1A) was analysed to find the assocation with litter size in goat as a candidate gene. Hinf- RFLP (Restriction Fragment Len
7、gth polymorphism, RFLP) of MTNR1A was found in 65 Boer goats and 51 goats Ma Tou. No polymorphism was detected in Ma Tau goats . Two genotypes AA, GG were found in Boer goats. The frequency of AA genotype was higher than GG genotype, which were 0.554 and 0.446, respectively. The allele frequencies f
8、or A and G were 0.554 and 0.446. The results of traits association analysis showed that individuals with AA genotype had additional 0.07 average litter size at first kidding in Boer Goat. The additive effect value was 0.035, while the dominant effects value -1.42. Moreover, AA genotype had additiona
9、l 0.09 average litter size for multiparity, the additive and dominant effects value were 0.046 and -1.84, respectively. Allele A was possiblely positively correlated with litter size in Boer goats. The additive effect was dominant at the site. Key words: Goat; Reproductive traits; MTNR1A; PCR-RFLP C
10、omment PY1: 参考文献中未列出 Comment PY2: 以上迹象表明,这 是直接从网上下载的。 华中农业大学本科毕业论文(或设计) 6 前前 言言 褪黑激素主要是由松果体合成的,其它合成部位还有:视网膜、眼眶腔的副 泪腺、唾液腺、肠的嗜铬细胞及红细胞,松果体把对外界光照形成的神经信息 经下丘脑视交叉上核转变成体液信息MEL。 1.褪黑激素生理功能、作用机制; 褪黑激素对生殖系统作用的机理主要是通过光作用于视网膜,然后通过视 网膜- 下视丘至视交叉上核,再经过一系列复杂的神经交换至颈上神经节,其 节后交感神经作用于松果体。松果体分泌褪黑激素,通过下丘脑垂体性腺轴 影响生殖系统。褪黑激
11、素对生殖系统的作用因动物种类、生理状态不同而表现 出抑制、促进或无作用的多重性(焦传珍,2005) 。多项研究结果表明,褪黑激 素虽然对牛、鼠类、禽等动物和人的生殖系统的发育有抑制作用,但是对绵羊、 山羊、鹿等动物则明显表现出促进作用。 2褪黑激素受体类型、作用机制; 褪黑激素受体属于 G 蛋白耦联受体家族。根据其分子生物学方法又可分为 MTNR1A、MTNR1B、MTNR1C 三种亚型(张凯等,2006)。目前在哺乳动物中还没 有发现MTNR1C 受体,而具有明显季节性繁殖特征的动物仅在垂体结节部发现 MTNR1A 受体,提示垂体结节部可能是褪黑激素繁殖效应的作用位点。 3褪黑激素受体分子标
12、记在其它动物中的研究进展 目前国内外对绵羊 M TNR1A 基因已经有所研究已经很多了。Messer 等 (1997)和 Notter 等(2003)用 M n l和 R sa酶分别对白面杂种羊、萨福克 羊、特克塞尔羊、柯泊华斯羊和合成系绵羊群体M TNR1A 基因外显子 2 的 824 bp 扩增产物进行消化,发现 M n l在 5 个绵羊群体中都存在 286 bp 和 236 bp 多态片段, R sa都存在 295 bp 和 290 bp 多态片段。Pelletier 等 (2000)用 M n l限制性内切酶消化 2 组发情行为有明显差异(常年发情和季 节性发情)的 Merinos d
13、Arles 母绵羊以及季节性发情明显的 Ile2de2France 母 绵羊M TNR1A基因外显子 2 的 824 bp 扩增产物,发现存在 303 bp 和 236 bp 多态片段。季从亮等(2003)和 Chu 等(2003)用 M n l和 R sa对常年发 情的小尾寒羊和湖羊以及季节性发情的多赛特羊和萨福克羊共 146 只绵羊M TNR1A 基因外显子 2 的 824 bp 扩增产物进行 PCR-RFLP 多态性分析,发现 M n l在 4 个绵羊品种中都存在 303 bp 和 236 bp 多态片段, R sa都存在 290 bp 和 267 bp 多态片段。在绵羊中的研究结果表明
14、,该基因对绵羊繁殖性能存 在影响。但是,对于山羊,只有对产绒或营养调控的研究,目前尚未发现有对 山羊繁殖性能影响的相关报道。 Comment PY3: 与滑国华的区别? 更确切地说,创新点?或特色? 华中农业大学本科毕业论文(或设计) 7 4本实验目的意义 本实验室滑国华等(2006)在山羊MTNR1A 中共发现 7 个 SNPs,对其中 4 个 SNPs 分析结果显示:MTNR1A不同基因型对山羊产羔数性状有一定的影响。 为进一步研究该基因对山羊产羔数性状的影响,本试验选取 G493A 突变位点, 采用引入酶切位点方法,即限制性片段长度多态性 Forced PCR- RFLP(Polymer
15、ase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphsim) , 分析该位点在马头山羊和波尔山羊中的分布情况,并分析该位点对波尔山羊产 羔数影响,为山羊标记辅助选择提供理论依据。 1.1.材料与方法材料与方法 1.11.1 材料材料 1.1.11.1.1 试验动物试验动物 马头山羊 51 头,采自湖北省十堰市;波尔山羊 65 头,采自湖北省宜都市 波尔山羊种羊场。颈静脉采血 10ml/只,EDTA 抗凝,-20保存。 1.1.21.1.2 实验材料实验材料 1.5ml Eppendorf 管、双面板、微量移液枪 (1000l、200l
16、、40l、10l、2.5l)及枪头、 一次性 PE 塑料手套。 1.1.31.1.3 主要试剂的来源主要试剂的来源 TagDNA聚合酶购自上海生工生物工程技术有限公司; DNA限制性内切酶Hinf购自晶美生物工程有限公司; 分子量标准100bp DNA Ladder和PBR322DNA/MspI购自上海生工生物工程技 术有限公司; 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 、苯酚、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠(SDS) 、甲 酰胺、丙烯酰胺(Acrylamide,Acr) 、NN亚甲基丙烯酰胺 (Bisacrylamide) 、琼脂糖、溴化乙锭(EB) 、琼脂糖、乙二胺乙二酸二钠盐 (EDTANa2)等均购自
17、武汉凌飞科技有限公司。 华中农业大学本科毕业论文(或设计) 8 1.1.41.1.4 主要仪器设备主要仪器设备 表表 1 1 主要仪器设备主要仪器设备 Table 1 Laboratory equipment and instruments 仪器设备名称型号生产厂家 电热恒温水浴锅 GD120 英国 Grant 公司 台式离心机 TGL-16G 上海安亭科学仪器厂 梯度 PCR 仪T1 Thermo cyler德国 Biometra 公司 冷冻离心机 Centrfuge 5810 德国 eppendorf 公司 恒温摇床 HS80 中国科学院武汉科学仪器厂 自动双重纯水蒸馏器 SZ-93 上海
18、亚荣生化仪器厂 紫外分析仪 UV-IV 北京市新科技应用研究所 电泳槽 DYY-III 北京六一仪器厂 稳压稳流电泳议 DYY-2 北京六一仪器厂 手提式高压灭菌锅 YXQ-SG46-280A 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 超纯水仪 WaterPro 美国 LABCONCO 公司 移液器 1ml;200l;40l; 10l;2.5l 芬兰 Labsystems 公司 1.1.51.1.5 主要试剂的配置主要试剂的配置 1.1.5.11.1.5.1用于血液样品采集的溶液的配制用于血液样品采集的溶液的配制 1) 1M Tris.cl储备液:称取121.4g Tris碱溶于800ml双蒸水中,加浓
19、盐酸调 至pH=8.0,定容到1000ml。高压灭菌,室温保存; 2) 0.5M EDTA(pH=8.0):称取186.1g Na2EDTA2H2O溶于800ml双蒸水中,加 入NaOH(约20g)调至pH=8.0,定容到1000ml。高压灭菌,室温保存; 3) 10%SDS:称取50g SDS加热溶于400ml双蒸水中,定容至500ml。高压灭菌, 室温保存; 4) 抗凝剂(0.2MEDTA):量取200ml 0.5M EDTA加入双蒸水定容至500ml。 1.1.5.21.1.5.2 用于基因组用于基因组DNADNA提取的溶液的配制提取的溶液的配制 1) 蛋白酶K:称取200mg蛋白酶K溶
20、于10ml双蒸水,以1ml分装,-20冷冻保存; 2) 氯仿/异戊醇(24:1):量取480ml氯仿,加入20ml异戊醇,混匀; 华中农业大学本科毕业论文(或设计) 9 3) 3M NaAc:称取NaAc3H2O溶于400ml双蒸水中,用HAc调至pH=5.2,加水定 容至500ml。高压灭菌,室温保存; 4) TE缓冲液:100mM Triscl(pH8.0) ,1mM EDTA(pH8.0) 。 1.1.5.31.1.5.3 用于琼脂糖凝胶电泳及检测溶液的配制用于琼脂糖凝胶电泳及检测溶液的配制 1) 50TAE储备液: 称取242g Tris碱溶于750ml双蒸水中,加入57.1ml HA
21、c、100ml 0.5M EDTA(pH8.0) ,加水定容至1000ml; 2) 5TBE储备液:称取54g Tris碱和27.5g硼酸溶于750ml双蒸水中,加入 20ml 0.5M EDTA(pH8.0) ,加水定容至1000ml; 3) 6上样缓冲液:0.25%溴酚兰,0.25%二甲苯青,15%Ficoll聚蔗糖; 4) 溴化乙锭(EB,10mg/ml):100ml双蒸水中加入0.1g EB,搅拌使完全溶解, 转入棕色试剂瓶,锡箔包裹。 1.1.5.41.1.5.4 用于聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染的溶液的配制用于聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染的溶液的配制 1) 30% 丙烯酰胺(丙烯酰胺:甲叉
22、双丙烯酰胺29:1):700ml双蒸水中加入 290g丙烯酰胺,10g甲叉双丙烯酰胺,搅拌使完全溶解,加水定容至 1000ml,4保存; 2) 10% 过硫酸铵:称取1g过硫酸铵溶于8ml双蒸水,定容至10ml; 3) 10% 乙醇:量取50ml无水乙醇溶于450ml水中,混匀; 4) 1% HNO3:量取15ml浓HNO3溶于985ml双蒸水中,混匀; 5) 0.2% AgNO3:称取1g AgNO3溶于500ml双蒸水中,置于棕色试剂瓶; 6) 3% Na2CO3(0.05%甲醛):称取30g无水Na2CO3溶于900ml双蒸水中,加入 1.5ml甲醛,定容至1000ml; 7) 3% H
23、Ac:量取30ml冰HAc溶于970ml双蒸水,混匀。 1.21.2 方法方法 1.2.1.1.2.1.山羊基因组山羊基因组 DNADNA 的提取的提取 从山羊颈静脉采血10ml,放入装有抗凝剂(0.5mol/L EDTANa2)的离心管 中,6000r/min离心15min,弃上清,吸取白细胞沉淀(参杂少量红细胞)于另 一离心管中;加入两倍体积双蒸馏水(灭菌) ,摇匀沉淀,静置10min15min, 破碎红细胞;6000r/min离心15min,轻轻弃去上清,留白细胞沉淀;加入 1SET 5ml,蛋白酶K(10mg/ml)0.1ml至终浓度200ng/ml,10% SDS 250l至 终浓度
24、0.5%,55水浴消化过夜;加入等体积饱和平衡酚轻轻摇匀, 12000r/min离心15min,轻轻吸取上层水相于另一离心管中,弃下相苯酚;重复 上步;加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1) ,轻轻摇动10min,12000r/min 离心15min,轻轻吸取上层水相于另一离心管中,弃下层有机相;加入等体积氯 华中农业大学本科毕业论文(或设计) 10 仿/异戊醇(24:1) ,轻轻摇动10min,12000r/min离心15min,轻轻吸取上层水 相于另一离心管中,弃下层有机相;加入两倍体积预冷无水乙醇,轻轻转动管 子,DNA呈絮状析出,用1ml吸头(灭菌)吸出DNA沉淀,放入1.5m
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