药品微生物限度检查方法介绍.ppt
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1、1,药品的卫生学检查方法介绍,(北京市药品检验所 戴红),2,无菌室的质量管理 药品的微生物限度检查 药品的无菌检查,3,无菌室的要求,位置选择 面积大小 洁净度 采光 紫外杀菌 门 人流物流 地面墙面,4,无菌室的管理,陈设尽量简单,仅放置必需用的仪器设备 无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭擦拭操作台及可能污染的死角,室内无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时。 人员:肥皂洗手, 0.1%新洁尔灭洗手,换无菌服、鞋,进入。 操作必须符合无菌要求,穿好无菌服后,不能反复出入无菌间,手不能来回出入操作台。 在每次操作完毕,同样用上述消毒溶液擦拭工作台面,除去空气湿气,用紫外灯杀菌半小时。 非无
2、菌室工作人员不得进入,对外来维修人员要进行监督。 缓冲间不得放杂物、培养箱等。 定期对门、窗、墙面等消毒。 定期检查洁净度情况。,5,洁净度的要求,应在环境洁净度10000级局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须无菌。 工作台面及环境应定期按医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游 菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。,6,尘埃粒子 洁净级别 尘粒数/m3 活微生数(个)/m3 0.5um 5um 100级 3,500 0 5 1000级 350,000 20,00 100 100000级 3,500,000 20,000 500 GB/T16294-1996 沉降菌
3、 洁净级别 个/(90mm.0.5h) 100级 1 10000级 3 100000级 10,7,菌种保存、复壮及管理,保存原则 保存方法 复壮 管理,8,菌种的保存原则,挑选特征典型的纯菌菌落 确定保存的合适菌体形态,凡能产生孢子或芽孢的微生物都用孢子或芽孢保存 选择最适宜的保存方法进行保存 定期对保存的菌种进行检查,9,菌种保存的常用方法,琼脂斜面低温保存法 甘油冷冻管保藏法 半固体琼脂斜面低温保存法 液体石蜡保存法 超低温保存法(菌种) 砂土,10,菌种的复壮,分离纯化:琼脂平板分离、单细胞(菌体或孢子)的分离 通过宿主复壮 淘汰退化 理化因素诱变,11,菌种的管理,专人管理,加锁保存在
4、冰箱内,保存菌种的冰箱不得放置食品及易挥发性试剂及有机溶媒等 定期有专人按操作规程进行传代接种 菌种定期检查,发现染菌及变异现象应及时报告,研究处理。 实验菌种不得任意带出 使用致病菌时应及时通知保管人员,用后必须及时处理,12,菌种,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26003 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10104 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64941 白色念珠菌(Candida albicans) CMCC(F) 98001 黑曲霉(Aspergi
5、llus niger) CMCC(F) 98003 大肠埃希菌(Escherichia coli) CMCC(B) 44102 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CMCC(B) 63501,13,菌液的制备(1),接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤中, 3035培养1824小时,取此培养液1ml加0.9无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法,稀释至10-5 10-7,使细菌数约为10100cfu/ml。,14,菌液的制备(2),接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中, 2328 培养1824小时,取此培养物1ml加0.9无菌氯化钠溶液
6、9ml,采用10倍递增稀释法,稀释至10-5 10-7,使细菌数约为50100cfu/ml。,15,菌液的制备(3),接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上, 2328 培养57天,加35ml0.9无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子,吸取出菌液,取1 ml加0.9无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法,稀释至10-410-6,使细菌数约为50100cfu/ml。,16,药品微生物限度检查方法介绍,17,2005年版微生物限度标准的应用,微生物限度检查法:检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。是判定药品受到微生物污染程度的重要指标,也是对生产企业的设备器具、工艺流程、生产
7、环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。 药品的生产、贮存、销售过程中的检验,原料及辅料的检验,新药标准制订,进口药品标准复核,考察药品质量及仲裁等,除另有规定外,其微生物限度检查均以本标准为依据。 检查项目:细菌数、霉菌数、酵母菌数及 控制菌的检查。,18,2005年版微生物限度标准的分类,1、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂 应符合无菌检查法的规定。 2、口服给药制剂 3、局部给药制剂 3.1. 用于手术、烧伤及严重损伤的局部给药制剂无菌 3.2. 眼部给药制剂: 3.3、耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂 3.4、阴道、尿道给药制剂 3.5、直肠给药制剂 3.6、其它
8、局部给药,19,4、含动物组织(包括提取物)的口服给药制剂 5、有兼用途径的制剂 应符合各给药途径的标准 6、霉变、长螨者 以不合格论 7、原料及辅料 参照相应制剂的微生物限度标准执行,20,供试品的抽样及检验取量,一般采用随机抽样方法,抽样量应为检验用量的3倍量(以备复试)。贵重药品检验量可以酌减(至少要够各种菌检查用的溶液)。 所有剂型的检验量均需取2个以上包装单位(中药密丸、膜剂,需取自4丸、4片以上)。 固体及半固体(粘稠性供试品)制剂检验量为10g。 液体制剂检验量为10ml。 膜剂除另有规定外,中药膜剂检验量为50m2,化学药及生化药膜剂检查量为10cm2。 抽样时,凡发现有异常或
9、可疑的样品,应选取有疑问的样品,但明显破裂的包装不得作为样品。 凡能从药品、瓶口(外盖内侧及瓶口周围)外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品,可直接判为不合格品,无需再抽样检验。,21,供试品的保存,供试品在检验之前,应保存在阴凉干燥处,勿冷藏或冷冻,以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死或繁殖。 供试品在检验之前,应保持原包装状态,严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。,22,细菌、霉菌、酵母菌计数,23,实验前的准备工作,将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管(1ml、10ml)量筒等移到无菌室内,每次试验所用物品必须事先计划,准备足够用量,避免操作中出入,操作编号后将
10、全部外包装(牛皮纸)去掉。 开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置,并使其工作不低于30min。 操作人员用肥皂洗手,关闭紫外灯,进入缓冲间,换工作鞋。再用0.1%新洁尔灭或其他消毒液洗手或用乙醇棉球擦手,穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。 操作前先用乙醇棉球擦手,再用碘伏棉球(也可用乙醇棉球)擦拭供试品瓶、盒、袋的开口处周围,待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。,24,平板菌落计数法,供试液制备 (10倍递增稀释) 注平皿 倒培养基摇合 (45营养琼脂 玫瑰红钠琼脂 YPD琼脂培养基) 倒置培养 ( 3035 48小时;2528 72小时) 菌落点数 (30300个 30100个) 菌数报告 (10
11、条原则),25,供试液的制备(1),乳化剂、分散剂、中和剂及其用量应证明是有效的,并对微生物无毒性。 水浴加温时,温度不超过45,时间不超过30分钟。 供试液从制备到加入培养基,不超过1小时。 供试液的体积:最终体积为100ml。,26,供试液的制备(2),稀释剂: pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液 肠溶制剂 pH7.6磷酸盐缓冲液、 pH6.8磷酸盐缓冲液 非水溶性供试品 乳化剂:5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80的无菌混合物(事先配制好、灭菌消毒)。 十四烷酸异丙酯萃取或过滤,27,供试液的制备(3),液体供试品 取供试品10ml,置灭菌锥形瓶中,加入稀释剂至100ml ,摇
12、匀,作为1:10供试液。 含王浆或蜂蜜的液体制剂和滴眼剂直接用供试品作为供试液。 固体、半固体或粘稠供试品,称取供试品10g,置于匀浆杯或适当灭菌容器中,加入稀释剂至100ml ,用匀浆仪(3000-5000r/,24min)、振荡器或乳钵研磨等方法混匀。胃溶胶囊加稀释剂后置451水浴振摇,肠溶胶囊加无菌磷酸盐缓冲液后451水浴振摇。,28,供试液的制备(4),非水溶液性供试品 软膏剂、乳膏剂、称供试品5g(5ml),加到含已灭菌溶化并45保温的乳化剂的烧杯中,用无菌玻棒搅拌混匀后,慢慢加入45左右的稀释剂85ml,边加边搅拌,使供试品充分乳化,作供试液(1:20)。 油剂取供试品10ml,加
13、入无菌聚山梨酯80 5 8ml,摇匀,再加入稀释剂至100ml。 栓剂,称取供试品10g,置灭菌锥形瓶中,加适量稀释剂,置45水浴保温10min,使溶,加入灭菌聚山梨酯80 58ml,振摇使之乳化,再加稀释剂(稀释剂和聚山梨酯80总量为100ml),摇匀。,29,供试液的制备 气雾剂,将供试品置冰箱(4-8)1h,取出,用碘伏棉球(也可用乙醇棉球)擦拭试品开启部位周围,然后以无菌钢锥钻孔并插入容器中,勿移出钢锥,以转动方式使容器抛射剂全部抛出。以无菌注射器吸出全部溶液,按标示量补加稀释剂至足量(若含非水溶性成分,加适量无菌聚山梨酯80液)此液即为供试品原液。 膜剂 将药膜剪成碎片,置灭菌锥形瓶
14、中,加入稀释剂至100ml,于451水浴中保温,振摇使溶。 茶剂,取供试品10g,置灭菌锥形瓶中,加入稀释剂至100ml,振摇30s,以灭菌纱布过滤,(如为袋泡茶,可直接取2袋,以称样结果按1:10加稀释剂,浸泡30min)。 以上供试品如吸水膨胀,或粘度过高,可增加稀释剂,制成1:201:100供试液。,30,供试品溶液的制备(5)(含抑菌成分的供试品),稀释法:10ml供试液种入较大体积的培养基中,一般不超过1000ml 离心沉淀法:3000rpm,30min,底部2ml稀释至10ml。500rpm,5min,上清液再离心集菌 薄膜过滤法:0.45um的滤膜,冲洗3次,每次至少100ml
15、中和法:磺胺类 100ml增菌液中含1%的对氨基苯甲酸1ml 砷、汞类 100ml硫乙醇酸盐培养基 洗必泰类 100ml增菌液中加适量的聚山梨酸80等表面活性剂 沉降法:自然沉降5min,取上层液置100ml增菌液中,31,供试液的稀释(10倍递增稀释法),10g 100ml 1:10 1ml 10ml 1:100 1ml 10ml 1:1000 至少3个稀释级,每递增1个稀释级,必须更换吸管。 管内混合吹打不少于10次,吸液在液面下2.5cm处,放液在液面上1cm处,延内壁缓缓吹出全部溶液,然后将吸管放入消毒液缸内。,32,注平皿,在进行10倍递增稀释的同时,以该稀释级吸管,吸取各种稀释液各
16、1ml至每个灭菌平皿中(从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管),每一稀释级注2-3个平皿(此时一般为左手执平皿,将盖半开,右手执吸管),注平皿时,将1ml供试液慢慢全部注入平皿中,管内无残留液体,防止反流到吸管尖端部。同时作阴性对照(待各级稀释液注皿完毕后,用1支1ml吸管取稀释剂各1ml,分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照;另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照,如另用YPD琼脂测定酵母菌数时,则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照。,33,倒培养基摇合,将预先配制好的培养基(细菌计数用营养琼脂、霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红钠琼脂,含蜂蜜、王浆液体制剂另用YPD琼脂)熔化、冷至约45时,倾注
17、上述各个平皿约15ml,以顺时针或反时针方向快速旋转平皿混匀,注意,混匀时切勿将培养基,溅到皿边及皿盖上,置操作台上待凝。,34,倒置培养,培养细菌计数平板倒置于30-35培养箱中培养48h。 霉菌、酵母菌计数平板倒置于23-28培养箱中培养72h。,35,菌落计数,细菌数选取平均菌落数在30300之间的稀释级。 霉菌、酵母菌数先取平均菌落数在30100之间的稀释级。 因为超过300有凝聚作用,易计数偏低,且不易点计,低于30细菌分布不是正态分布,不能代表其正常计数,且数量减少,误差增大。,36,菌落报告原则,如只有1个稀释级平均菌落数在30300(30-100)之间,则将该稀释级的菌落乘以稀
18、释倍数报告。 稀释 菌落数 平均值 报告 10 1 280 260 270 270102700 10 2 29 28 10 3 3 2,37,如有2个相邻稀释级平均菌落数在30300(30-100)时,则按比值计算。当比值2时,则以2个稀释级的平均菌落数均值报告。 高稀释级平均菌落数稀释倍数 比值= 低稀释级平均菌落数稀释倍数 稀释 菌落数 平均值 10 1 大于300(无法计数) 10 2 280 260 270 10 3 38 40 39 比值39000/270001.4 小于2 报告(27000+39000)/233000,38,如有2个相邻稀释级平均菌落数在30300(30-100)时
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