专题一 基因工程.ppt
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1、基因工程是指按照人们的意愿,进行严格的设计,并通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫做DNA重组技术。,专题一 基因工程,一、DNA重组技术的基本工具,(一)限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1.分布:,2.特点:,特异性,即能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且切割每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,使之断开。,主要从原核生物中分离纯化出来,G A A T T C,C T T A A G,G,C T T A A,G,A A T T C,C C C
2、 G G G,G G G C C C,C C C,G G G,G G G,C C C, ,中轴线, ,EcoR (在G与A之间切割),Sma (在G与C之间切割),粘性末端,平末端,切割DNA分子产生的两种不同的末端(箭头表示酶的切割位点),3. 结果:在识别序列中轴线两侧切割,产生粘性末端; 在识别序列中轴线处切割,产生平末端。,(二)DNA连接酶“分子缝合针”,(二)DNA连接酶“分子缝合针”,(二)DNA连接酶“分子缝合针”,2.连接酶的部位:,磷酸二酯键,不是氢键,1.连接酶的作用:,将互补配对的两个黏性末端连接起来,使之成为一个完整的DNA分子,3.连接酶的类型(按来源分类),(1)
3、 E.coli DNA连接酶: (来源于大肠杆菌),只能连接双链DNA片段互补的粘性末端,(2) T4 DNA连接酶: (来源于T4噬菌体),既可以连接双链DNA片段 互补的粘性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,(三)基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,1.作用:,2.条件: 能在宿主细胞内复制并稳定地保存; 具有多个限制酶切位点,便于目的基因插入; 具有标记基因,便于筛选; 必需是安全的,对宿主细胞无害。,将外源基因送入受体细胞,3.种类:,质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒,质粒 细菌拟核DNA之外能自主复制的小型双链环状DNA分子; DNA分子上具有多个限制酶切割位点; 能在宿
4、主细胞中进行自我复制; DNA分子上具有特殊的标记基因; 对宿主细胞无影响。,二、基因工程的基本操作程序,获取目的基因,构建表达载体,导入受体细胞,目的基因检测与鉴定,第一步,第二步,第三步,第四步,(一)目的基因的获取,1.从基因文库中获取目的基因,(1)基因组文库,将含有某种生物不同基因的许多片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。,受体菌包含了某种生物所有的基因,该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。,(2)部分基因文库,受体菌包含了一种生物部分基因,该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库,如cDNA文库。,(3)基因文库的构建,基因组文库的构
5、建,提取某生物 全部DNA,用适当 限制酶切割,许 多 DNA片段,与载体连接 导入受体菌群,该生物基 因组文库,(每个受体菌含有一段不同的DNA片段),cDNA文库的构建mRNA反转录形成,mRNA,逆转录酶,杂交双链,核酸酶H,单链DNA,DNA聚合酶,双链DNA,与载体连接 导入受体菌群,该生物 cDNA文库,2.利用PCR技术扩增目的基因,(1) 原理,PCR是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),它是利用DNA 双链复制的原理,将基因的核苷酸序列不断的加以复制,使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行,所以又叫做体外DNA扩增技术。,2. 过程
6、,高温变性(DNA解旋)(9095),低温退火(引物结合)(5560),中温延伸(互补链合成)(7075),双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的,因此整个过程不需要解旋酶。,多次重复,3.特点:指数形式扩增,推测,推测,合成,3.通过DNA合成仪直接合成目的基因,DNA合成仪,蛋白质的氨基酸顺序,mRAN 核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时,可采用此种方法。,(二)基因表达载体的构建,用限制酶切割质粒使之出现一个切口,将目的基因插入切口处,让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后,在连接酶的作用下连接形成重组
7、DNA分子,即基因表达载体。,质粒,目的基因,限制酶,(二)基因表达载体的构建,1.构建目的,使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可遗传给下一代,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。,2.构建零件及其作用,(1)目的基因,(2)启动子 RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA,进而获得需要的蛋白质。,(二)基因表达载体的构建,(3)终止子 一段特殊结构的DNA片段,位于基因的尾端,作用是使转录在所需要的地方停止。,(4)标记基因 鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,(二)基因表达载体的构建,
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