实验一、16S rRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析.ppt
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1、马玉超 北京林业大学生物科学与技术学院 办公地点:生物楼117;电话:62336016; Email:,现代微生物学实验技术,实 验 内 容,16S rRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 大肠杆菌-半乳糖苷酶的诱导表达 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取,16S rRNA基因的PCR扩增、电泳 及系统发育分析 窦 桂 铭,实 验 目 的,掌握PCR的原理,增强对PCR重要性的认识; 掌握电泳技术及系统发育分析的方法,为将来课题研究奠定基础。,PCR(Polymerase Chain Reaction)法,又称为
2、聚合酶链反应或PCR扩增技术,是一种高效快速的体外DNA聚合程序,设想实现改进与完善,72,94,55,PCR循环,PCR技术的反应原理,PCR技术的反应原理,DNA或RNA模板,5,5,待扩增DNA区域,3,94 5 min,5,5,55,退火,5,5,聚合,3,3,5,5,3,循环25-30次,变性,70,DNA引物,DNA聚合酶,dNTPs,Mg2+(缓冲液),1 2,5,5 ,目的基因,变性,加热,5 ,引物,退火,5 ,底物,延伸,5 ,5 ,加热,变性,5 ,退火 引物,30个循环:230 目标DNA片段达106-107,变性退火延伸,5 ,2 4,5 ,5 ,一个标准的PCR过程
3、,核酸的凝胶电泳,基本原理 当一种分子被放置在电场中时,它们就会以一定的速度移向适当的电极。 这种电泳分子在电场作用下的迁移速度电泳的迁移率。 迁移率的影响因素:电场长度、电泳分子的电荷数量、电泳分子与支持介质的摩擦系数等。 在生理条件下,核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的叫做多聚阴离子。方向:负正 种类:,二、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖:线性多糖聚合物、从红色海藻产物琼脂中提取而来。 加热凝固:网孔状的电泳介质,密度由琼脂糖的浓度决定。,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的能力,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围: 0.2-50kb,凝胶浓度 线形DNA的最佳分辨范围(bp) 0.5% 1,0
4、0030,000 0.7% 80012,000 1.0% 50010,000 1.2% 4007,000 1.5% 2003,000 2.0% 502,000,琼脂糖,DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响:,核酸 分子量的大小 分子状态,物理 电压 缓冲液 温度,电泳指示剂:溴芬兰,距边缘1cm左右停止电泳。 电泳染色剂:溴化乙锭(ethidium bromide,简称EtBr), 扁平染料, 嵌到DNA或RNA分子的碱基之间,借助紫外灯观察。,DNA Marker,1.2kb 800bp,操 作 步 骤,操 作 步 骤,(1) 称取琼脂糖,用适当的电泳缓冲液(常用1TAE)配
5、成所需浓度的胶;10TAE 缓冲液配制:0.4M Tris-乙酸;0.02M EDTA,pH8.0 (2) 置微波炉中加热煮沸,直至琼脂糖完全溶解; (3) 按照每20ml胶加入1l Goldview/20ml; (4) 凝胶溶液冷却至50左右,倒入电泳胶盘,避免出现气泡,室温放置,至胶凝固; (5) 小心拔出梳子,将胶盘放到有1TAE 缓冲液的水平电泳槽中; (6) 样品中加入1/5 体积的6loading buffer,混匀,用移液器小心加到点样孔中,以稳定电压(4-5V/cm) 电泳;6加样指示剂配方:0.25% 溴酚蓝;40%(W/V) 蔗糖水溶液; (7) 取出凝胶,紫外灯下观察电泳
6、结果,如有必要,拍照记录。,琼脂糖凝胶电泳:,Ribosomal RNA Sequences,核糖体RNA序列与进化,(1)具有重要且恒定的生理功能; (2)普遍存在于原核生物和真核生物中,而且在系统发育上具有适当的保守性; (3)分子量大小适中,在细胞中含量大(约占细胞中RNA的90%) (4)高度保守、中度保守和高度变化的序列区域,适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。,小核糖体亚单位RNA(16S rRNA,18S rRNA),16S rRNA的系统发育分析,1 AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGT
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