实验二细菌基因组DNA的提取.ppt
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1、细菌基因组DNA的提取,一、实验原理,1、核酸的分类,DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA,如线粒体DNA(mtDNA),叶绿体DNA(cpDNA),质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中,如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA,RNA外,还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体,其或只含DNA,或只含有RNA。,核酸制备时应注意的事项: 尽量简化操作步骤,缩短提取时间。 减少化学因素对核酸的降解。 减少物理因素对核酸的降解:机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解。,核酸制备的步骤:,核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度,改变pH及盐的浓度,都利于对核酸酶活性的抑制,但均不如利用
2、核酸酶抑制剂更有利,当然,几个条件并用更好。 对于DNA,抑制DNase活力很容易,但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA,因分子较小,不易被机械张力拉断,但抑制RNase活力较难,故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。,3、核酸制备的一般方法和原理,DNase抑制 加入少量金属离子螯合剂,如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠,DNase基本可以全部失活。 去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。,RNase抑制 操作要带手套。 所有器皿要严格消毒, 试剂处理 低温操作 在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。,核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷,结合带正
3、电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂,一般都是阴离子去垢剂,去垢剂的作用: 1溶解膜蛋白及脂肪,使细胞膜破裂; 2溶解核小体上的蛋白质,使其解聚,将核酸释放出来; 3对RNase、DNase有一定的抑制作用。,如:SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠,核酸制备中常用的蛋白质变性剂 1.使蛋白质变性、沉淀,从核酸提取液中分离除去,以防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性,故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。,如:苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC,核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶,细胞破
4、碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸,核酸提取的一般过程,细胞破碎 机械方法: 超声波处理法、研磨法、匀浆法; 化学试剂法:用SDS处理细胞; 酶解法: 加入溶菌酶或蜗牛酶,破坏细胞壁。 DNA提取 SDS(十二烷基硫酸钠 )法 :SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵 )法 :CTAB是一种阳离子去垢剂,它可以溶解膜与脂膜,使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来,并使蛋白质变性,使DNA与蛋白质分离。 DNA纯化(去杂质) 蛋白质: 常用苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)或氯仿:异戊醇(24:1)抽
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