实验六-酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定.ppt
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1、酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定,蔗糖酶活性及比活性测定原理,+,蔗糖酶,蔗糖酶的酶活单位:在40水浴反应10min,测定吸光值A540,增加0.01个光吸收值的酶量为一个酶活力单位(U)。 蔗糖酶比活力测定:每毫克蔗糖酶蛋白所具有的活力单位,对同一种酶来说,酶的比活力越高,酶的纯度越高。,试剂 (一) 蔗糖酶的粗提及活性测定 (1)冰冻无水乙醇:1瓶/班 (2)0.01 mol/L pH6.0 PBS buffer,2000ml (全班共用) (3)0.01mol/L蔗糖, 用0.01 mol/L pH6.0 PBS buffer配制,200ml (大组共用) (4)2 mol/L NaOH,
2、 1000ml (全班共用) (5)3,5-二硝基水扬酸(DNS)试剂:可配300ml (全班共用) 19.2克酒石酸钾钠溶于50ml水中(电炉加热溶解,不用沸腾),把.0.63克3,5-二硝基水杨酸(DNS)和26.2ml2 mol/L NaOH 加到酒石酸钾钠的热溶液中,电炉加热溶解,冷却到50-60,再加0.5克苯酚和0.5克亚硫酸钠搅拌使溶解冷却后加水定容至100ml,过滤,贮于棕色瓶中。,实验方法 (一)粗提取酵母蔗糖酶 (1) 量取5g的面包酵母,分几次研磨(加入少量石英砂)至粉状,再加入10-12ml的0.01mol/LPBS(pH 6.0),搅拌混合。置于小烧杯中。 (2) 置
3、于20冰箱中,反复冻融1-2次。,(二)热提取酵母蔗糖酶 (3) 解冻,然后置于离心管中,离心,转速11000r/min离心10min,离心后取上清液,按下表2、3方法分别测蔗糖酶A的活性及蛋白含量(蛋白含量略)。 (4) 将上述上清液置于45的恒温水浴锅中,用玻璃棒缓慢搅拌30min,然后置于冰浴中迅速冷却5min。然后装入离心管中,离心,转速11000r/min条件下离心10min,离心后取上清液,按下表2、3方法分别测蔗糖酶B的活性及蛋白含量。,(三)乙醇提取酵母蔗糖酶 (1)取上述第4步中的上清液10ml,缓慢加入10ml的冰冻的无水乙醇(乙醇的终浓度为50),并轻轻的搅拌5min,此过程在冰浴中进行。然后装入离心管中,转速3000r/min条件下离心5min,离心后弃上清液,离心管倒置于滤纸上,尽可能去除乙醇残液。留沉淀。 (2)将沉淀用15ml的0.01mol/L的PBS(pH6.0)搅拌溶解30min,溶液为浑浊液,再离心,转速10000r/min条件下离心10min,离心后取上清液,按下表2、3方法分别测蔗糖酶C的活性及蛋白含量。,表1 酵母蔗糖酶酶活性及比活力测定,注意: 对照管的颜色不能太深,如果太深,需要重新配蔗糖溶液。,实验结果分析 思考题: (1)比较哪种蔗糖酶的粗提方法使酶的活性及纯度较高。 (2)本实验中有哪些影响蔗糖酶活性的因素。,
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