中药指纹图谱研究生(盛习锋).ppt
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1、中 药 指 纹 图 谱,盛习锋,第一章 中药指纹图谱技术与中药质量控制 1.1 指纹图谱的起源与发展 现代指纹鉴定始于19世纪末20世纪初的范罪学和法医学。每个人的指纹在微小的细节构造上各有不同,可以据以鉴别每个人的特征。 指纹图谱技术应用于植物药质量控制,是从20世纪70年代,色谱技术的发展,人们大量采用薄层色谱(TLC)方法,将植物中化学成分展载于由各种担体铺成的薄层板上。根据薄层板上的斑点的位置、斑点大小、斑点颜色、斑点数目的多少进行定性鉴别,这种薄层鉴别方法具备了指纹图谱的特征。 20世纪70年代及80年代,出现薄层扫描仪,日本和我国部分学者用薄层扫描仪得到复方成药扫描图作为色谱指纹图
2、尝试应用于药材及成药分析。 20世纪80年代及90年代,高效液相技术得到发展,同时植物药中化学成分的分离鉴定、活性成分的不断阐明,高效液相广泛应用于定性、定量分析。 西方普遍采用高效液相色谱法对植物药中已知及未知组分进行控制,并形成相应的规范。目前高效液相色谱法已成为当前研究指纹图谱的主要手段。,1.2 中药指纹图谱的定义 中药指纹图谱鉴别借用了法医学的指纹鉴定的概念。 定义:运用现代分析技术对中药化学信息以图形(图像)的方式进行表征并加以描述。 由次生代谢产物组成的中药提取物的色谱指纹图谱不仅具备个体的绝对的惟一性,更强调的是物种特征的惟一性与同种植物中的相似性。 现代分析技术:包括光谱、波
3、谱、色谱、核磁共振、X射线衍射及各种技术的联用。 中药化学信息:植物药(包括来源于植物的中药材)的提取物(包括中药的汤药)与化学合成药最根本的区别是,它(即使是单味药材)是多种化学成分的混合体。这种多种化学成分的综合体构成了“中药化学信息”。由于中药的疗效由多种成分协同作用或“相克作用”,中药中的化学信息有一定的模糊性。只有部分化学信息(包括已知的活性成分、已知的非活性成分、一部分未知成分)可表征于指纹图谱中。,表征和描述:“表征”是将中药化学信息通过色谱图(液相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图)等方式进行表达;“描述”是对指纹图谱经过计算、分析、比较、评价等过程,以技术参数、指纹特征等加以说明
4、。 中药指纹图谱研究须经过制备、分析、比较、评价和校验等过程。 分析色谱指纹图要求“准确的辨认”,不是“精密的测量”; 比较供试品与对照品的色谱指纹图谱是要求“相似”,而不是“相同”; 评价色谱比较的结果,是根据色谱指纹图谱的模糊属性,着眼于宏观的规律性的特征分析,即着重辨认完整色谱的“图貌”,而不是求索细枝末节。 分析比较的结果,是对供试品与对照品之间的差异或一致性作出评价。,1.3中药指纹图谱与中药安全、有效、稳定和可控的关系 药物研究的主要内容包括药物安全性、有效性、稳定性和可控性,四者缺一不可。 已生产并临床使用的注射剂等中成药,由于经过了药效学测试、临床评价,安全性与有效性没有,但是
5、,现有的质量控制方法的不全面性及生产过程中的不稳定性导致各批次产品之间质量出现差异,在临床应用过程中往往出现非正常的医疗事故。,指纹图谱研究的直接目的有两个方面: (1) 对中药质量控制的补充和提高。 现有中国药典质量控制方法及新药申报资料7,往往以1个或个以上成分为控制指标,在一定程度上反映了原药材、中间体及成品的质量,但任何单一的成分都难以准确、全面地评价中药质量,不仅不能进行真伪鉴别和优劣判别,在很多情况下,所检测的指标成分(活性成分)还不具有“惟一性”,使用器材比较简单,操作比较粗糙,有时重现性差。 中药注射剂指纹图谱研究的技术要求要求将指纹图谱检测指标及持续术要求作为质量标准单列项目
6、,是对现行中药质量控制标准的有益补充。 一个理想的指纹图谱不仅能达到定性鉴别的目的,色谱图中大部分药谱理应达到基线分离,对大部分成分应可进行定量分析。在没有对照品的情况下,也可以已知标准品针对其他未知或无标准品的色谱峰进行定量。因此,中药指纹图谱是对现行中药质量标准近控制方法的提高。,(2) 控制中间体、成品的一致性,减少批间差异 中药生产的原材料,因土壤、气候等环境因素及采收加工的不同,实际使用时不能保证药材质量的稳定,经加工提取得到的中间体,每个批次在成分含量、成分组成及各成分比例方面都不能保持一致。 通过指纹图谱研究,可以掌握每一个批次的原药材、中间体中成分变化,进行有指导的合理“勾兑“
7、,保证成品在成分含量、组成比例上一致,减少批间差异。 无论是原药材、中间体还是成品,因组方已固定、生产工艺相对恒定,药品的安全性不可能直接通过指纹图谱来保障,但中药指纹图谱可直接解决中间体、成品的批间一致性及稳定性问题,从而可以间接并最终保障成品的安全性和有效性。,一致性,安全性,指纹图谱,可控性,有效性,1.4 中药指纹图谱建立的意义与原则 中药指纹图谱建立的是全面反映中药内在化学成分的种类与数量,进而反映中药的质量。现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确,采用中药指纹图谱的方式,将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可,有利于中药及产品进入国际市场。 中药指纹图谱的建立,应以系统的化
8、学成分和药理学研究为依托,应体现系统性、特征性、重现性三个基本原则。,系统性: “系统性“是指指纹图谱所反映的化学成分应包括中药有效部位所含大部分成妥的种类,或指标成分的全部。 如:中药人参中所含的有效成分多为皂苷类化合物,则其指纹图谱应尽可能多地反映其中的皂苷成分;银杏叶中的有效成分是黄酮和银杏内酯类,则其指纹图谱可采用两种方法针对这两类成分,分别分析,以达到系统、全面的目的。,特征性: “特征性“是指指纹图谱中反映的化学成分信息(具体表现为保留时间或位移值)是具有高度选择性的,这些信息的综合结果,将能特征地区分中药的真伪与优劣,成为中药自身的”化学条码“。 如:北五味妇的高效液相色谱和薄层
9、色谱指纹图谱,不仅包括多种已知的五味子木脂素成分,而且还有很多未知成分,这些成分之间的顺序、比值在一定范围内是固定的,并且随药材品种的不同而不同。通过这些整体信息,可以很好地区分北五味子与南五味子以及其它来源的五味子药材,辨别药材的真伪与优劣。,重现性: “重现性“是指所建立的指纹图谱,在规定的方法与条件下,不同的操作者和不同的实验室应能作出相同的指纹图谱,其误差应在允许的范例内,这样才可以保证指纹图谱的使用具有通用性和实用性,也是作为标准方法所必备的特征之一。 实现指纹图谱的重现性,除在样品制备方法、分析过程、结果处理待环节规范操作外,还应建立相应的评价机制,对指纹图谱进行客观评价,并公布标
10、准指纹图谱。 实现中药指纹图谱的三原则,保证其标准化,做到统一规范,这样才可以使中药指纹图谱得以推广应用。,1.5 国外植物药指纹图谱的应用 美国FDA:允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图; WHO:1996年草药评价指导原则中规定,如果草药的活性成分不明,可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致。 欧共体:在草药质量指南中称,单靠测定某有效成分考察质量的稳定性是不够的,因为草药及其制剂是以整体为活性物质。在欧共体药品申请注册表格中植物药制品的“药物专家报告“要求通过已知的具有治疗作用的活性物质对原料、中间体及成品进行标准化控制。,第二章 中药指纹图谱研究方法学 2.1 常用指纹图谱研究
11、的方法与技术 研究对象的不同,指纹图谱研究的方法与技术也不同,并都随着现代科技技术的发展而发展。 中药指纹图谱研究所采用的方法大致分为:色谱法、光谱法及其它。 色谱法包括:薄层色谱法(TLC)、液相色谱法(LC)、气相色谱法(GC)、高效毛细管电泳法(CE); 光谱法包括:紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、近红外光谱法(NIR); X射线衍射法、核磁共振法(NMR)等。,(1) X射线衍射法及核磁共振法 这两种方法能给出药效物质基础的结构信息,部分信息也可能与特定化学成分直接关联。但该两种方法所使用的仪器在国内尚未普及,不适应该方法的应用与推广。在中药指纹图谱研究过程中不建议采用X射线衍
12、射法及核磁共振法。 (2) 紫外可见分光光度法和红外光谱法 这两种方法能够给出药效物质基础的结构信息,但所给出的信息是所有化学物质结构结构信息的加和,不具备指纹特征,但可作为中药指纹图谱研究的辅助方法。,(3) 近红外光谱法 此方法与红外光谱法原理相同,但检测时采用近红外波长,所给出的信息是所有化学物质结构信息的加和,通过一系列样本的检测(必须预先知道样品中相关成分的含量或样本的定性归属),运用化学计量学手段,建立了样本与信息之间的数学模型。运用该模型即可对未知样本(如:新近购进的原药材或新生产的成品等)进行辨别分析(给出结果:合格与否、含量多少等)。 优点:检测速度快(通常为1 min)、操
13、作简单、适宜过程控制等。 数据处理需掌握一定的化学计量学知识。 近红外技术在农药、化工、农业等相关领域已广泛应用,方法的成熟度较高,在中药质量控制方面有较好的应用前景,可大力推广近红外技术在原材料质量控制中的应用。,(4) 薄层色谱法 薄层色谱法为传统的定性、定量分析方法,广泛应用于道地药材的定性鉴定。 2000版中国药典,采用薄层色谱法进行定性鉴别,列于【鉴别】项下;采用薄层扫描法进行含量测定,列于【含量测定】项下。 优点:操作简单、分析速度快、一次分析样品数量多。 缺点:重现性、精密度差。 可作为中药指纹图谱研究的借鉴与补充。 (5) 液相色谱法 最常用的指纹图谱研究方法,其中高效液相色谱
14、法(HPLC)具有分离效能高、选择性高、检测灵敏高、分析速度快、应用范围广等特点。 中药样品中含有的成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测,方法成熟,中药指纹图谱研究应优先考虑高效液相色谱法。,(6) 气相色谱法 气相色谱法主要用于分析气体、挥发性和半挥发性液体以及能够产生足够蒸气压的固体,或者沸点在500以下,相对分子质量400以下的物质。 在中药质量控制中主要用于挥发油、极性较小的成分或衍生化后的可挥发性成分(如脂肪酸的酯)。 特点:灵敏度高、分离度好、分析速度快,定量分析的精密度优于1%,但分析范围只局限于低沸点成分是其主要不足。为中药指纹图谱研究的主要方法之一。,(7) 高效毛细
15、管电泳法 高效毛细管电泳法是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型分离分析技术。适用于中药中带电荷的化合物(蛋白质、氨基酸、黄酮、生物碱)、有机酸、单糖及一些中性分子的分离分析,可作为中药指纹图谱研究的补充。 (8) 其它 高效液相色谱与质谱联用(HPLC-MS)、气相色谱与质谱联用(GC-MS)、毛细管电泳与质谱联用(CE-MS)等。 这些方法可在指纹图谱中的部分色谱峰在无标准物质验证的情况下,起到定性鉴别的作用。 最 常用为:TLC、HPLC、GC。,2.2 指纹图谱研究常用的仪器与设备 2.2.1 薄层扫描仪 (1) 薄层扫描流程,点样 洗脱展开 扫描检测 数据处理,(2) 薄
16、层扫描仪主要部件 典型的薄层扫描仪主要由机械扫描装置和数据处理两部分组成,新型的薄层扫描仪配有自动点样器等。 (3) 主要厂家及仪器型号 日本岛津CS系列;美国Schoeffel SD3000等。 2.2.2 高效液相色谱仪 2 2.2.3 气相色谱仪,2.3 指纹图谱研究对高效液相色谱仪的要求 2.3.1 柱外效应 应特别注意“柱外效应”对分析结果的影响。 由于样品分子在液体流动相的扩散系数比在气体中小45个数量级,液体流动相的流速也比气相慢12个数量级,因此,样品注入色谱柱后,在柱子以外任何死空间(如进样器、柱接连接管和检测器)中,样品分子的扩散和滞留都会显著引起色谱峰的扩散,而使柱效降低
17、,所以柱外死体积的影响量不能忽略。 在制造和使用高效液相色谱仪时,应使柱外效应减至最小,以获得理想的分析结果。 建议:色谱柱及检测器前死体积应最小。,2.3.2 流动相的脱气 流动相在使用前必须进行脱气处理,以除去其中溶解的气体(如O2),防止在洗脱过程中,因压力降低而产生气泡。若在低死体积检测池中存在气泡,会增加基线噪声,严重时会造成分析灵敏度下降而无法进行分析。 溶解在流动相中的氧气会造成荧光猝灭,影响荧光检测器的检测;可导致样品中的某些级组分被子氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。 常用的脱气方法有离线式脱气和在线式脱气。 离线式脱气:吹氦脱气法、加热回流法、抽真空脱气法、超声
18、波脱气法等。离线式脱气会因流动相存放时间的延长以致有空气重新溶解在流动相中; 在线式脱气技术是把真空脱气装置串接到贮液系统中,并结合膜过滤器,实现流动相在进入输液泵前的连续脱气。在线式脱气法的脱气效果明显优于离线式脱气法,并适用于多元溶剂体系。 建议:选择在线脱气。,2.3.3 梯度洗脱 梯度洗脱是流动相中含有两种或两种以上的不同极性的溶剂,在洗脱过程中连续或间断改变流动相的组成,以调节它的极性,使每个流出的组分获得最理想的分离效果,并使样品中的所有组分可在最短的分析时间内,以适用的分离度获得圆满的选择性分离。分为高压梯度和低压梯度两种方式进行操作。 由于高压梯度装置中,每种溶剂是分别由泵输送
19、的,进入混合器后,溶剂的可压缩性和溶剂混合时的热力学体积的变化,可能影响输入到色谱柱的流动相的组成,因此高压梯度洗脱过程中为保证流速稳定必须使用恒流泵,否则很难获得重复性结果。 低压梯度是在常压下将多元溶剂输至混合器中。 优点是:仅需要使用一个高压输液泵;减小了溶剂可压缩性的影响,并能完全消除由于溶剂混合引起的热力学体积变化带来的误差。 建议:选择低压梯度。,2.3.4 样品进样 进样器有以下几种: (1) 停流进样装置 为防止在带压操作下引起流动相泄露,此装置要求进样前压降至常压下再进样,操作繁琐,已较少使用。 (2) 六通阀进样装置 该方法重现性较好,较常用。 (3) 自动进样器 自动进样
20、器由计算机自动控制定量阀,按预先编制的注射样品操作程序工作。取样、进样、复位、样品管路清洗和样品盘的转动,全部按预定程序自动进行,一次可进行几十个或上百个样品的分析。 自动进样的样品量可连续调节,适合大量样品分析,节省人力。 (4) 建议:中药指纹图谱研究过程中,由于对样品的进样量精确度要求不高,因此对进样器的选择可结合研究者的实际情况,建议选择六通阀手动进样装置。,2.3.5 色谱柱 2.3.6 柱温 不同柱温下同一成分在的保留时间往往发生迁移,有时还影响成分之间的分离效果。 由于中药样品成分的复杂性,尤其是中药指纹图谱技术要求色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的相对恒定,对柱温的要求应严格控
21、制,以保证分析方法的重现性。 建议:选择柱温箱。,2.3.7 检测器 (1) 紫外线检测器 应用最广,要求分析样品必须在紫外线区有吸收。 特点:灵敏度高、线性范围宽,可做成很小池体积的流通,对流动相的流速和温度变化不太敏感,易操作,不破坏样品,波长可以选择及可用于梯度洗脱。 (2) 示差折光检测器 示差折光检测器是通用型检测器,对在可见光或紫外线区无吸收的样品一般选用。不破坏样品,缺点是对温度变化敏感,不能用低梯度洗脱,灵敏度低,不能用于痕量分析。 (3) 荧光检测器 (4) 电化学检测器,(5) 二极管阵列检测器 光束通过流通池、分光系统后,使所有波长在二级管阵列检测器同时检测器,可得三维的
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