生化基础知识.ppt
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1、2019/2/27,1,生化基础知识,上 海 赛 伦 生 物 技 术 有 限 公 司,张 浩,2019/2/27,2,生物化学(Biochemistry),是生命的化学,在分子水平探讨生命的本质。生物化学的主要任务是阐述活细胞内及细胞间的化学反应及其与生命活动的关系。 1、研究生物分子的结构及功能。 包括蛋白质、核酸、脂类及糖等。 2、新陈代谢及其调节。 3、遗传信息的贮存、传递、表达及调控(分子生物学)。,2019/2/27,3,结合生产需要,1.蛋白质化学 2.酶学概论 3.血液生化,主要介绍,2019/2/27,4,第一部分 蛋白质化学,2019/2/27,5,蛋白质,是由许多不同的-氨
2、基酸按一定的序列通过酰胺键(肽键)缩合而成的。 具有较稳定的构象并具有一定生物功能的大分子。,2019/2/27,6,一、蛋白质的生物学意义,1. 生物体的组成成分 2. 酶 3. 运输 4. 运动 5. 抗体 6. 干扰素 7. 遗传信息的控制 8. 细胞膜的通透性 9. 高等动物的记忆、识别机构,2019/2/27,7,二、蛋白质的元素组成,C(5055%)、H(68%)、O(2023%)、 N(1518%)、 S(04%)、 N的含量平均为16% 是凯氏定氮法的理论基础,2019/2/27,8,三、蛋白质的氨基酸组成,氨基酸是蛋白质的基本组成单位。 从细菌到人类,所有蛋白质都由20种标准
3、氨基酸(20 standard amino acids)组成。,2019/2/27,9,(一)氨基酸的结构通式,除脯氨酸外, 其它所有氨基酸在结构上都有一个共同的特点,即在与羧基相连的-碳原子上含有一个氨基。从这个结构通式可以看出,氨基酸的差别就表现在侧链R基团上。 Pro具有二级氨基(-亚氨基酸),2019/2/27,10,氨基酸的构型: 氨基酸的构型是以D-、L-甘油醛为标准确定的。 除甘氨酸外, 其他所有-氨基酸都是L-型的。,2019/2/27,11,C如是不对称C(除Gly),则: 具有两种立体异构体 D-型和L-型 具有旋光性 左旋(-)或右旋(+),2019/2/27,12,(二
4、)氨基酸的分类,根据側链R基的极性,20种氨基酸可分成4类 (1)极性氨基酸:1)不带电:Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys 2)带正电:His、Lys、Arg 3)带负电:Asp、Glu (2)非极性氨基酸:Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp,2019/2/27,13,甘氨酸(Glycine,Gly,G), 丙氨酸(Alanine,Ala,A), 缬氨酸(Valine,Val,V), 亮氨酸(Leucine,Leu, L), 异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I), 脯氨酸(Proline,Pro,P), 苯丙氨酸(Phenylalani
5、ne,Phe,F), 色氨酸(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸(Methionine,Met,M),1. 非极性R基氨基酸(共9种):,2019/2/27,14,2.无电荷的极性R基氨基酸(共6种):,丝氨酸(Serine,Ser,S), 苏氨酸(Threonine,Thr,T), 酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C), 天冬酰胺(Asparagine,Asn,N), 谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q),2019/2/27,15,3.带正电荷的极性R基氨基酸(共3种):,赖氨酸(Lysine,Lys,K), 精氨酸(Argin
6、ine,Arg,R), 组氨酸(Histidine,His,H) 4.带负电荷的极性R基氨基酸(共2种): 天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D), 谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E),2019/2/27,16,根据R的化学结构 (1)脂肪族氨基酸: 1)疏水性:Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys; 2)极性:Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr (2)芳香族氨基酸:Phe、Tyr (3)杂环氨基酸:Trp、His (4)杂环亚氨基酸:Pro,2019/2/27,17,紫外吸收特性,酪氨酸和色氨酸在280nm处具紫外吸收特
7、性,蛋白质通常含有这样的氨基酸。 故可以在280nm处测定蛋白质的含量。,2019/2/27,18,(三)氨基酸的重要理化性质,1、一般物理性质 无色晶体,熔点极高(200以上),不同味道;水中溶解度差别较大(极性和非极性),不溶于有机溶剂。 2、两性解离和等电点 氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在,在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的NH3+正离子和能接受质子的COO-负离子,为两性电解质。,2019/2/27,19,氨基酸在不同的pH条件下可解离成带不同的电荷,COOH COO- COO- | H | H | H3NCH H3NCH H2NCH | -H | +H | H H
8、H 酸性状态(pHpI) 两性离子状态(pH=pI) 碱性状态(pHpI),调节氨基酸溶液的pH,使氨基酸分子上的+NH3基和COO-基的解离程度完全相等时,即所带净电荷为零,此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点(pI)。,2019/2/27,20,3.化学性质 (略) (1)与茚三酮的反应 (2)与甲醛的反应 (3)与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应 (4)与异硫氰酸苯酯(PITC)的反应 (5)与荧光胺反应 (6)与5,5-双硫基-双(2-硝基苯甲酸)反应,2019/2/27,21,四、肽,蛋白质是由单一肽链或多条肽链构成的大分子。 这些多肽链在长度上一般超过40个以上的氨基
9、酸残基,最大者甚至超过4000个氨基酸残基。 若按氨基酸残基平均分子量110计,则蛋白质分子量范围大约是4 000-440 000 Da(4-440 kD)。,2019/2/27,22,1肽、肽链和肽键,氨基酸与氨基酸之间可以通过-氨基和-羧基形成的酰胺键共价地结合在一起,这样形成的产物叫做肽(Peptide)。 在蛋白质化学中,这种酰胺键称为肽键 (Peptide bond)。 由氨基酸借肽键所形成的一条线性的链状分子就叫做肽链(peptide chain) 。 在肽链结构中,每个的氨基酸不再是完整的,因此叫做氨基酸残基(residue)。,2019/2/27,23,2.肽的性质,1肽键可被
10、水解 2肽的解离性质 肽是一类多聚两性电解质,随环境pH的变化,可以电离成带正电荷、负电荷或者净电荷为零等不同的状态。 每一种多肽都有它的等电点,可通过酸碱滴定曲线来确定。等电点的差别反映出它们的氨基酸组成不同和侧链可电离基团的种类和性质的差别。,2019/2/27,24,3.生物活性肽,几乎所有生物体内部都存在多种非蛋白质肽。这类物质都有相应的生物活性,尽管人们并不完全清楚它们的功能。通常我们把这些肽类统称为生物活性肽。 生物活性肽在组成、结构和大小方面存在很大的差异。有的呈环形,有的有分支,有的还含有D-氨基酸和氨基酸类似物。,2019/2/27,25,谷光甘肽(GSH) 催产素和升压素
11、促肾上腺皮质激素(ACTH) 脑肽 胆囊收缩素 胰高血糖素,2019/2/27,26,五、 蛋白质的结构,蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。 在蛋白质中,多肽链折叠形成特殊的形状(构象)(conformation)。在结构中,这种构象是原子的三维排列,由氨基酸序列决定。 蛋白质有四种结构层次: 一级结构(primary) 二级结构(secondary) 三级结构(tertiary) 四级结构(quaternary)(不总是有)。,2019/2/27,27,(一)蛋白质的一级结构(化学结构),一级结构就是蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序,即氨基酸的线性序列。 在基因编码的蛋白质中,这种序列
12、是由mRNA中的核苷酸序列决定的。 一级结构中包含的共价键(covalent bonds)主要指肽键(peptide bond)和二硫键(disulfide bond),2019/2/27,28,2019/2/27,29,(二)蛋白质的空间结构(构象、高级结构),蛋白质空间构象 是指蛋白质多肽链主链在空间上的走向及所有原子和基团在空间中的排列与分布。 蛋白质的空间结构包括: 二级结构 三级结构 四级结构。,2019/2/27,30,1. 蛋白质的二级结构 指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕方式,(1)-螺旋(-helix) (2)-折叠结构(-pleated sheet) (3)-转角(-turn
13、) (4)自由回转,2019/2/27,31,(1)-螺旋(-helix),3.613 (ns),2019/2/27,32,(2)-折叠结构(-pleated sheet),2019/2/27,33,(3)-转角(-turn),2019/2/27,34,(4)自由回转,没有一定规律的松散肽链结构。酶的活性部位。,2019/2/27,35,2. 超二级结构和结构域,超二级结构是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用,形成有规则的,在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。 结构域是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密
14、的近似球行的结构,具有部分生物功能。对于较大的蛋白质分子或亚基,多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构。,2019/2/27,36,3. 蛋白质的三级结构,指多肽链上的所有原子(包括主链和侧链)在三维空间的分布。 肌红蛋白,2019/2/27,37,4. 蛋白质的四级结构,多肽亚基(subunit)的空间排布和相互作用。亚基间以非共价键连接。 血红蛋白,2019/2/27,38,化学键,(三)蛋白质分子中的共价键与次级键,-是蛋白质空间构象稳定的因素,2019/2/27,39,六、蛋白质分子结构与功能的关系,(一)蛋白质一级结构与功能的关系 1. 种属差异 蛋白质一级结构的种属差异十分明显
15、,但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白质结构上的差异,可以断定它们在亲缘关系上的远近。 2.分子病 蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序与正常有所不同的遗传病。,2019/2/27,40,-链 1 2 3 4 5 6 7 Hb-A Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys Hb-S Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys,镰状细胞贫血(sick-cell anemia) 从患者红细胞中鉴定出特异的镰刀型或月牙型细胞。,2019/2/27,41,(二)蛋白质构象与功能的关系,别(变)构作用:含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象
16、、性质和功能发生改变的作用。因别构而产生的效应称别构效应。 血红蛋白是别构蛋白,O2结合到一个亚基上以后,影响与其它亚基的相互作用。,2019/2/27,42,七、蛋白质的性质,2019/2/27,43,(一)蛋白质的相对分子量,蛋白质相对分子量在10 0001 000 000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 最准确可靠的方法是超离心法(Svedberg于1940年设计):蛋白质颗粒在2550*104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。 沉降系数(s):单位(cm)离心场里的沉降速度。 沉降系数的单位常用S,1S=110-13(s),v =沉降速
17、度(dx/dt) =离心机转子角速度(弧度/s) x =蛋白质界面中点与转子中心的距离(cm),2019/2/27,44,蛋白质分子量(M)与沉降系数(s)的关系,R气体常数(8.314107ergsmol -1 度-1) T绝对温度 D扩散常数(蛋白质分子量很大,离心机转速很快,则忽略不计) V蛋白质的微分比容(m3g-1) 溶剂密度(20,gml-1) s沉降系数,2019/2/27,45,(二)蛋白质的两性电离及等电点,蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷,在偏碱溶液中带负电荷,在等电点pH时为两性离子。 电泳:带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同,迁移率即异
18、,在电泳时可以分开。,2019/2/27,46,1. 自由界面电泳:蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 2. 区带电泳:将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳,不同组分形成带状区域。 (1)纸上电泳:用滤纸作支持物。 (2)凝胶电泳:用凝胶(淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺)作支持物。,平板电泳:铺有凝胶的玻板上进行的电泳。,圆盘 电泳: 玻 璃 管 中 进 的 凝 胶 电 泳。,2019/2/27,47,3.等电聚焦电泳:当蛋白质在其等电点时,净电荷为零,在电场中不再移动。,2019/2/27,48,(三)蛋白质的胶体性质,布郎运动、丁道尔现象、电泳现象,不能透过半透膜,具有吸附能力。 蛋白质溶液稳
19、定的原因: 1)表面形成水膜(水化层); 2)带相同电荷。,2019/2/27,49,(四)蛋白质的沉淀反应,1. 加高浓度盐类(盐析):加盐使蛋白质沉淀析出。 分段盐析:调节盐浓度,可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。 血清球蛋白(50%(NH4)2SO4饱和度),清蛋白(饱和(NH4)2SO4)。 2. 加有机溶剂 3. 加重金属盐 4. 加生物碱试剂 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱,称生物碱试剂。,2019/2/27,50,(五)蛋白质的变性,天然蛋白质受物理或化学因素的影响,其共价键不变,但分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化,致使其原有性质发生部分或全部
20、丧失,称为蛋白质的变性。 蛋白质的变性只破坏其空间结构而不破坏它的一级结构。 变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失。溶解度降低,易形成沉淀析出,结晶能力丧失,分子形状改变,肽链松散,反应基团增加,易被酶消化。 变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固。,2019/2/27,51,(六)蛋白质的颜色反应,见后页,2019/2/27,52,OH,2019/2/27,53,蛋白质的其他反应,成盐反应 酰基化和烃基化反应 成酯反应 酰氯化反应 成酰胺反应 脱羧反应 迭氮反应,2019/2/27,54,八、蛋白质的分离纯化,蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。 目前常使用的分离纯
21、化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。 目标蛋白质的分离决不是一件轻而易举的事情,因为要把它与性质、大小和结构十分相似的其他蛋白质分离开来存在许多困难。有些目标蛋白质在组织细胞内的含量很低,这无疑将增加获取足量蛋白质的难度。,2019/2/27,55,目标蛋白质的分离纯化程序,材料的选择; 组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液; 蛋白质初步提纯; 选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化; 目标蛋白的鉴定。 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此,在目标蛋白质的整个分离纯化过程中要在较低温度下(04)操作,注意使用蛋白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂,避免使用剧烈
22、条件,以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏,2019/2/27,56,1、根据蛋白质是两性电解质分离,1. 蛋白质的电泳分离 凝胶电泳是目前常用的一种生化方法。用于蛋白质分离的凝胶主要是聚丙烯酰胺凝胶,该凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺配制而成,其最大的特点是凝胶的孔径可根据需要进行选择。以聚丙烯酰胺凝胶为支持物,可进行非变性电泳和变性电泳。 非变性电泳:蛋白质样品未进行变性处理,凝胶中没加入变性剂,通过电泳分离的蛋白质仍具有生物活性。 变性电泳:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 。SDS是一种带负电荷的阴离子去垢剂,它能使蛋白质变性、肽链伸展,并吸附在伸展的肽链上,吸附的
23、量与链长成比例。常用来测定蛋白质亚基的大小和鉴定蛋白质的纯度。 等电聚焦:是在聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上发展起来的一种用于检测蛋白质的方法,它与SDS-PAGE结合构成的双向电泳技术可用于确定蛋白质的亚基组成及电荷异构体的分析。,2019/2/27,57,电泳后的蛋白质检测 考马斯亮蓝染色是常用的一项电泳染色方法,是根据考马斯亮蓝能与蛋白质多肽链定量结合的原理而建立起的。对于一个混合蛋白质的电泳分离来说,它只能检测样品的分离情况;如果被检蛋白质的位置可以确定,可以将该蛋白质的色带切下之后进行脱色,测定脱色液光吸收值,能对该蛋白质进行定量分析。 活性染色是根据有活性的目标蛋白质特有的生物化学反应
24、产生的有色物质或另外加入某种能与产物生成颜色的物质来进行检测的.活性染色可以从一个复杂的蛋白质样品中检测到目标蛋白出现的位置。 免疫印迹或蛋白质印迹是检测目标蛋白质的一项十分有效的方法。一种蛋白质(抗原)能与它产生的抗体专一地反应。在电泳之后,欲检测目标蛋白的存在,可以先将凝胶中的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上,然后用目标蛋白产生的抗体与之产生抗原-抗体反应,最后可用连接有碱性磷酸酯酶或辣根过氧化酶的第二抗体(通用抗体)与第一抗体反应,加入能与抗体共接的酶反应生成有色物质的生色液,即可十分可靠地检到的目标蛋白,2019/2/27,58,2.蛋白质的离子交换柱层析分离 用于蛋白质分离纯化的离子交换
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