生化实验05凯氏定氮法.ppt
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1、1,实验06 植物组织中总氮含量的测定 (微量凯氏定氮法),2,氮素代谢在植物新陈代谢中占有主导地位。测定氮素含量对于研究植物的氮素吸收、运输和代谢规律,以及确定农产品品质、营养价值等均具有一定意义。 动植物组织中的氮包括蛋白氮和非蛋白氮两大类,主要以有机氮形式存在。由于蛋白质的含氮量相对稳定,测定出样品中总氮含量,再乘上一个系数即可得出样品中粗蛋白含量。如要准确测定蛋白质含量,则需利用三氯乙酸将样品中蛋白质沉淀出来,再分别测定蛋白氮和非蛋白氮。 组织中含氮量常用凯氏定氮法测定。,3,一、原理,在催化剂(如CuSO4、K2SO4、硒粉等)存在的条件下,将植物材料与浓硫酸共热,有机物氧化分解成C
2、O2和H2O,其中的氮转变为氨,并进一步生成(NH4)2SO4,这个过程称为消化。在消化后的样品中加入过量的NaOH,经强碱碱化使之分解释放出NH3,通过蒸馏借蒸汽将NH3导入过量的硼酸溶液中生成四硼酸铵;再用标准盐酸滴定,直到硼酸溶液恢复到原来的H+浓度,根据盐酸的用量即可计算出样品中总氮的含量。,4,一、原理,以甘氨酸为例的化学反应式: 消化:CH2NH2COOH + 3H2SO42CO2 + 3SO2 + 4H2O+NH3 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 蒸馏: (NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O + Na2SO4 + 2NH3 2NH3 + 4H3BO3 (NH
3、4)2B4O7 + 5H2O 滴定:(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O 2NH4Cl + 4H3BO3,5,材料:面粉 仪器设备:消化管、分析天平、微量凯氏定氮蒸馏装置、容量瓶、三角瓶、滴定管、移液管、消煮炉等。 试剂: 1. 浓硫酸(AR级);2. 30%(W/V)NaOH; 3. 30%H2O2; 4. 0.01mol/L HCl标准溶液; 5. 2%硼酸溶液; 6. 混合催化剂; 7. 混合指示剂; 8. 标准(NH4)2SO4溶液,二、材料、仪器设备及试剂,6,凯氏定氮蒸馏装置,全自动凯氏定氮仪,7,三、实验步骤,1. 样品消化(已完成) 准确称取0.1-0.2g样品(依
4、其含氮量而定)至消化管中,加入5mL浓硫酸和0.3-0.5g混合催化剂,浸泡数小时后在管口盖一小漏斗,放在消煮炉上加热消化。开始时温度可稍低,加热至管口不再产生泡沫时可逐渐升温,使消化管内液体达到微沸,直到消化液褐色消失并全部变为清澈透明为止。 在消化过程中,可分数次加入少许H2O2以加速有机物氧化。如发现在消化管上部有黑色颗粒,应小心转动消化管,用消化液将其冲洗下来。整个过程一般需3-4小时,均应在通风橱中进行。,8,2. 定容: 消化液冷却后,沿管壁仔细加入10mL左右无氨蒸馏水以冲洗管壁冷却后转入100mL容量瓶,再用少量无氨蒸馏水冲洗消化管数次,洗涤液一并转入容量瓶冷却后用无氨蒸馏水定
5、容至刻度,混匀后备用。,3. 蒸馏 (1)仪器洗涤:在蒸汽发生器中加入2/3体积蒸馏水关闭汽水分离器阀和进样漏斗、并使管道联通打开冷凝管打开电炉加热蒸汽发生器,用热蒸汽通入仪器各部分清洗15min。,9,3. 蒸馏 (1)仪器洗涤 冲洗完毕,从加样漏斗向蒸馏反应管加入无氨蒸馏水,清洗蒸馏反应管打开汽水分离器阀、夹紧蒸汽发生器与蒸馏反应管之间的橡皮管,由于冷却减压使得反应瓶中废液被虹吸进入隔热套中打开隔热套下端的活塞阀排出废液。如此清洗2-3次。 可将冷凝管下口浸入硼酸-指示剂混合液中检测清洗效果,当硼酸-指示剂混合液不变色时,表明蒸馏装置清洗干净 。,10,3. 蒸馏 (2)样品蒸馏 在三角瓶
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