生化课件2 蛋白质.ppt
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1、1.掌握蛋白质化学组成和分类; 2.掌握氨基酸分类、结构、和分离分析方法,氨基酸的两性性质,pI 和 Pk,重要化学反应; 3.弄清楚蛋白质的一级结构及其序列分析方法;了解二、三和四级结构基本概念; 4.了解蛋白质的生物功能、重要理化性质; 5.了解蛋白质分离、纯化方法及其理论依据; 6.了解结合蛋白的分布、特性和生物功能。,第二章 蛋白质,2019/2/27,蛋白质是各种氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的含氮的生物大分子,是生命存在的形式。蛋白质存在于所有的生物细胞中,是动植物和微生物细胞中最重要的有机物质之一,是生活细胞中数量、种类最丰富的生物大分子,是构成生物体最基本的结构物质和功能
2、物质。蛋白质是生命活动的物质基础,它参与了几乎所有的生命活动过程。,2.1 蛋白质的分类,2019/2/27,一、蛋白质的重要作用,1.生物催化作用(酶) 2.结构物质(生物膜、结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白) 3.物质运输(血红蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体) 4.运动功能(肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白) 5.贮存功能(卵清蛋白、种子蛋白、铁蛋白等) 6.防御、免疫作用(抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白),7.接受和传递信息(受体蛋白,味觉蛋白、支架蛋白) 8.调节代谢、控制生长和分化功能(组蛋白、阻遏蛋白;调节新陈代谢的生理活性物质,如胰
3、岛素。) 9.感染和毒性作用(能引起机体中毒症状和死亡的异体蛋白,如细菌毒素、蛇毒、蝎毒、蓖麻蛋白等),2019/2/27,二、蛋白质组成与分类,1.化学组成,(1)元素组成: 主要组成元素为碳、氢、氧、氮;有的还含有少量的硫、磷、碘或金属元素(如铁、铜、锌等)。其中,C占50 55%, H 6 8%,O 20 23%,N 15 18%,S 0 4%。大多数蛋白质的N含量约为16%。 凯氏定氮:粗蛋白质含量=蛋白含氮量6.25 (2) 氨基酸组成 蛋白质是由20种基本氨基酸组成的长链分子,这些氨基酸中,大部分属于L-氨基酸;脯氨酸属于L-亚氨基酸,而甘氨酸则属于-氨基酸。,2019/2/27,
4、2.蛋白质的常见分类方法,(1)根据蛋白质的分子组成,简单蛋白质和结合蛋白质,清蛋白 球蛋白 谷蛋白 醇溶谷蛋白 组蛋白 鱼精蛋白 硬蛋白,简单 蛋白,结合 蛋白,核蛋白 脂蛋白 糖蛋白和粘蛋白 磷蛋白 色蛋白:血红蛋白 黄素蛋白 金属蛋白,根据溶解度的不同,根据非蛋白质即辅基的不同,血浆脂蛋白的组成、性质及功能,血浆脂蛋白(lipoprotein):血液中的脂类与蛋白质结合 成可溶性的复合物,是血脂的存在和运输形式。血浆中所含脂 类物质统称为血脂。 组成:血浆脂蛋白均由蛋白质(载脂蛋白,Apo)、甘油 三酯(TG)、磷脂(PL)、胆固醇(Ch)及其酯(ChE)所组成。 结构:通常呈球形颗粒。
5、颗粒外层为亲水的载脂蛋白和磷 脂的极性部分,疏水部分则伸入到内部,疏水的甘油三酯和胆 固醇被包裹在内部。,乳糜微粒 极低密度脂蛋白 低密度脂蛋白 高密度脂蛋白 CM VLDL LDL HDL,形成部位:小肠粘膜 肝细胞 血浆、肝 肝细胞,功能: 转运外源 转运内源 转运内源 逆向转运 甘油三酯 甘油三酯 胆固醇 胆固醇,血浆脂蛋白功能:,(2)根据蛋白质分子形状 球状蛋白质和纤维状蛋白质 (3)根据蛋白质生物功能 活性蛋白质和非活性蛋白质,活性蛋白质包括生命活动过程中一切有活性的蛋白质以及它们的前体分子。绝大多数蛋白质属于活性蛋白质,包括酶、激素蛋白、运输蛋白(转运蛋白)、贮存蛋白、运动蛋白、
6、保护或防御蛋白、受体蛋白、控制生长和分化蛋白、毒蛋白等。 非活性蛋白质对生物体起支持和保护作用,主要指硬蛋白包括胶原蛋白、角蛋白、丝蛋白、弹性蛋白等。,2.2 蛋白质的组成单位 氨基酸(Amino acid),一、氨基酸的结构 二、氨基酸的分类 三、氨基酸的理化性质 四、氨基酸的分离与分析 五、氨基酸的制备和应用状况,一、氨基酸的结构,生物体内的氨基酸包括三大类: 基本氨基酸:编码蛋白质的氨基酸,组成蛋白质,20种; 稀有氨基酸:是多肽合成后由基本AA经酶促修饰产生的,出现在一些蛋 白质的水解液中含有的少量氨基酸,如:胱氨酸、羟赖氨酸、羟脯氨酸、L- 甲状腺素等;含稀有氨基酸的蛋白质多具有较强
7、的活性。 非蛋白质氨基酸:氨基酸的衍生物,以游离或结合的形式存在于生物体 内。有些是重要的代谢前体或中间产物如-丙氨酸(维生素泛酸的前 体),瓜氨酸、鸟氨酸(精氨酸的前体); -氨基丁酸(神经递质)等, 还有些是-,-,-, 和D-型氨基酸;植物的非蛋白质氨基酸是其次生代谢 产物(中草药的药效成分),如:刀豆氨酸、黎豆氨酸和-氰丙氨酸。,蛋白质是由20种基本氨基酸组成的。,1.氨基酸的结构通式:,2.-氨基酸的构型: 构型:指在立体异构体中的原子或取代基团的空间排列关系。不同的空间排列称为不同的构型。(构型的改变涉及到共价键的形成和破坏,但与氢键无关。) 构象:一个分子结构中原子沿共价键转动而
8、产生的不同空间排列。(构象的改变会牵涉到氢键的形成和破坏,但不涉及共价键的破坏。) 氨基酸的构型分为D型和L型两种。即都有手性碳原子,在三维空间上两种不同的排列方式,它们互为镜影。它们是与甘油醛或乳酸相比较而决定的。凡是与L甘油醛(或L乳酸)构型相同的,就定义为L氨基酸,反之为D氨基酸。 生物体内组成蛋白质的AA都是L-型(除甘氨酸以外)。只在少数细菌细胞壁上发现D-型。,1.按照R基的化学结构分类 (1)脂肪族氨基酸:R为脂肪烃基的氨基酸(5种),a-氨基异戊酸,a-氨基异己酸,a-氨基-甲基-戊酸,二、 氨基酸的分类,Glycine,Alanine,Valine,Leucine,Isole
9、ucine,脂肪烃基的氨基酸R基均为中性烷基,对分子酸碱性影响很小,它们几乎有相同的等电点(6 .00.03) Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸,因此不具旋光性。 从Gly至Ile,R基团疏水性增加。 蛋白质多肽中Gly残基的存在将增加其结构区域的柔性。,R中含有羟基和硫的氨基酸(共4种),a-氨基-硫甲基-丁酸,a-氨基-巯基-丙酸,a-氨基-羟基-丁酸,Serine,Threonine,Cysteine,Methionine,Ser的-CH2 OH基(pKa=15)在生理条件下不解离,在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。 Ser和Thr的-OH往往与糖链相连,形成糖蛋白。 Cys
10、的R中含巯基(-SH),具有两个重要性质: (1)在较高pH值条件,巯基解离。 (2)两个Cys的巯基氧化生成二硫键,生成胱氨酸。 Cys与结石:半胱氨酸的强碱溶液是有效的溶石药物 Met在生物合成中是一种重要的甲基供体。,R中含有酰胺基团(2种),酰胺基中的氨基易发生氨基转移反应,Asparagine,Glutamine,R中含有酸性基团(2种)Asp、Glu,Asp侧链羧基pKa为3.86, Glu侧链羧基pKa为4.25 它们是唯一在生理条件下带有负电荷的的两种氨基酸。,a-氨基-丁二酸,a-氨基-戊二酸,Aspartic acid,Glutamic acid,R中含碱性基团(3种),a
11、, -二氨基己酸,a-氨基- -胍基-戊酸,a-氨基-咪唑基-丙酸,Lys侧链氨基的pKa为10.53,生理条件下,Lys侧链带有一个正电荷(NH3+),侧链的氨基反应活性增大。 Arg是碱性最强的氨基酸,侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱,pKa值为12.48,生理条件下完全质子化。 His是pKa值最接近生理pH值的一种(游离氨基酸中为6.00,在多肽链中为7.35 ) ,是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。 His在酶的酸碱催化机制中起重要作用,(2)芳香族氨基酸(3种),a-氨基-苯基-丙酸,a-氨基-对羟苯基-丙酸,a-氨基-吲哚基-丙酸,(3)杂环族氨基酸(1种) (4)杂
12、环亚氨基酸(1种),四氢吡咯-2-羧酸,Pro残基的存在将会增加蛋白质结构区域的刚性。,Proline,Histidine,2.根据氨基酸R基侧链的极性, 可将氨基酸分为:,疏水性氨基酸(非极性氨基酸),亲水性氨基酸(极性氨基酸),不带电荷的极性氨基酸,带正电荷的碱性氨基酸,带负电荷的酸性氨基酸,Asp Glu,Lys Arg His,Ser Thr Tyr Asn Gln Cys,Ala Val Ile Leu Pro Met Phe Trp Gly,3.根据生物体的需要, 可将氨基酸分为:,必需氨基酸,半必需氨基酸,非必需氨基酸,其余氨基酸,Arg His,Lys Val Ile Leu
13、phe Met Trp Thr,近年来的研究发现,原先被认为仅用作终止信号的无义密码子在某些情况下可重新诠释,编码特定的氨基酸,在揭示了硒代半胱氨酸由UGA编码后,最近的研究还表明,在某些古细菌和真细菌中,无义密码子UAG可重新诠释,编码组成蛋白质的第22种天然氨基酸吡咯赖氨酸。,哺乳动物体内的硒主要以硒代半胱氨酸的形式参与蛋白组成,硒代半胱氨酸也因其重要性被称作第21个氨基酸。,第21、22种蛋白质氨基酸 硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸,胱氨酸,非编码氨基酸,羟脯氨酸与羟赖氨酸,存于纤维蛋白、胶原蛋白及植物细胞壁的糖蛋白中,胶原蛋白,三、氨基酸的理化性质 (一)氨基酸的一般物理性质,a-氨基酸为无
14、色晶体,不同氨基酸其晶体形状不相同。 1.熔点:氨基酸 熔点较高,一般在200300C。 2.溶解度:氨基酸的溶解度差别很大,溶于稀酸稀碱,但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。3.味感:各种氨基酸有不同的味感:甜、鲜、苦、无味。谷氨酸的单钠盐有鲜味,是味精的主要成分 4.旋光性:除甘氨酸外,氨基酸都具有旋光性,能使偏振光平面向左或向右旋转,左旋者通常用(-)表示,右旋者用(+)表示。 5.光吸收:,芳香族氨基酸在pH8时紫外吸收光谱(280nm),20种基本氨基酸在可见光区没有光吸收,但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙
15、氨酸和色氨酸有吸收光的能力。,在280nm处,Trp吸收最强,Tyr次之,Phe最弱。280nm处光吸收的测定,是定量蛋白质浓度最常用的方法。,紫外吸收性受溶液pH的影响,氨基酸在水溶液和结晶都是以两性离子形式存在。,(二)氨基酸的酸碱性质(两性解离),正离子,两性离子,负离子,氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子,也能像碱一样接受质子,氨基酸具有酸碱性质,是一类两性电解质。,(1)氨基酸的等电点 pI:,1.等电点:,pI(等电点):指两性电解质所带正负电荷相等时溶液的pH值。 pI是pK1和pK2的算术平均数,即两性离子两侧的基团的pK值之和的一半:pI =(pK1+ pK2)/2,
16、例:加入酸或碱使Ala净电荷等于0时的pH值就是丙氨酸等电点。 pIAla=(2.34+9.69)/2=6.02,k1,k2,Ala+,Ala+,Ala+/ Ala,Ala,Ala-,Ala/Ala-,2,氨基酸的每一功能基团都能被酸碱所滴定,可根据氨基酸的滴定曲线来推算pK值:滴定中点时的pH。,(2)氨基酸的可解离基团的pK值。 pK值为某个可解离基团、侧链基团的解离常数的负对数。,两性离子两侧的pK之和的一半 中性的AA: pI=(pK1+pK2)/2 酸性AA: Glu、Asp pI= (pK1+pKR)/2 碱性AA: Arg、Lys、His pI=(pK2+pKR)/2,2.AA等
17、电点的计算,中性氨基酸:以Gly为例,酸性氨基酸,以Asp为例:,Asp+,碱性氨基酸,以Lys为例:,Lys+,结论:,在等电点时,氨基酸主要以两性离子存在,但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式,还有极少量的中性分子。 pH=pI时,等电点时的pH ,氨基酸净电荷为零; pHpI时,等电点以上的任何pH,氨基酸带净负电荷,在电场中将向正极移动; pHpI时,低于等电点的任何pH ,氨基酸带净正电荷,在电场中将向负极移动。 在一定pH范围内,氨基酸溶液的pH离等电点愈远,氨基酸所携带的净电荷愈多。,1、与茚三酮反应,-氨基酸与茚三酮试剂共热,可发生反应生成蓝紫色化合物(570nm处测定AA
18、的含量)。,蓝紫色化合物,(三)氨基酸的化学性质,氨基酸的化学反应,茚三酮反应与脯氨酸和羟脯氨酸反应则生成黄色化合物,其结构如下所示:,反应生成的化合物的颜色深浅程度以及CO2生成量,均可作为氨基酸定量分析依据(440nm处测定脯氨酸和羟脯氨酸含量)。,2、与亚硝酸反应 含游离-氨基的氨基酸能与亚硝酸起反应,定量地放出氮气,氨基酸被氧化成羟酸。在标准条件下测定生成的N2的体积,即可计算氨基酸的量。,Van Slyke 氨基氮测定法就是根据此反应原理。 蛋白质被水解时,a氨基不断增多,与亚硝酸反应放出的氮气量也随之增加。而蛋白质所含的总氮量是不变的。因此通过水解过程中的a氨基氮量的变化以及总氮量
19、的比例关系可以判断蛋白质的水解程度。 含亚氨基的脯氨酸则不能与亚硝酸反应。,3、Sanger反应(酰基化) 与DNFB的反应 2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱溶液中发生亲核芳香环取代反应生成黄色的2,4-二硝基苯基氨基酸(DNP氨基酸),英国的Sanger用这个反应来鉴定多肽N-未端的氨基酸,从而测定多肽或蛋白质的AA排序。 -NH2上的N是一个亲核中心,能发生亲核取代反应。H原子可被酰基、羟基取代。多肽的人工合成中被用作氨基保护。,DNFB,DNP-氨基酸(黄色) 2,4-二硝基苯基氨基酸,-氨基酸与异硫氰酸苯酯(PITC)(苯异硫氰酸)在弱碱条件下形成相应的苯氨基硫甲酰氨基酸(PTC-
20、氨基酸) (苯异硫氰氨基酸),与酸发生环化生成苯硫乙内酰脲(PTH)。 这是著名的Edman降解,进行多肽链N-未端氨基酸的测定。 现在根据此原理设计出了“蛋白质顺序测定仪” 。,4、Edman反应 与苯异硫氰酸(酯)的反应,与苯异硫氰酸(酯)的反应,PITC,异硫氰酸苯酯,苯异硫氰氨基酸,苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物,层析法分离后显色,多肽链N-未端氨基酸的测定,氨基乙内酰苯硫脲,5、与丹黄酰氯的反应: 氨基酸与 5一二甲氨基萘磺酰氯(简称丹黄酰氯,dansyl chloride, 或用DNS-Cl表示)反应,生成丹黄酰氯的衍生物。具有很强的荧光,可用于微量分析或肽链氨基末端氨基酸顺序分析。
21、,6、与甲醛反应:,氨基酸在溶液中有如下平衡:,甲醛滴定法:NH3+是一个弱酸,完全电离是的pH约在1213,用一般的指示剂很难准确判断其滴定的终点,一般不能直接用酸碱滴定法来定量测定氨基酸。在中性 pH和常温下甲醛能很快与氨基酸的a-氨基结合,产生羟化物。羟基诱导电子使氮上的电子密度降低,氮不再吸引质子,质子游离出来,使平衡向右移动,促使NH3+释放出质子,使溶液酸性增加,滴定的终点移动到pH9左右,这时可用酚酞作指示剂,用氢氧化钠滴定。每放出一个质子就相当于一个氨基酸。,二羟,甲醛滴定法不仅用于测定氨基酸含量,也常用来测定蛋白质水解程度。,7、与荧光胺反应,氨基酸可与荧光胺反应,产生荧光产
22、物, 可用荧光分光光度计测定氨基酸含量。,AA的 -羧基: 成盐和成酯反应:在HCl(干燥)存在下与无水甲醇(乙醇)作用即生成氨基甲酯(乙酯)(保护羧基,突出氨基) 。氨基酸与NaOH反应即得到氨基钠盐。,脱羧基反应: AA在生物体内经AA脱羧酶作用,放出二氧化碳并生成相应的一级胺。 成酰胺反应: AA与氨作用可形成氨基酸的酰胺,为生物体储NH3的主要反应。 动、植物体内的Gln、Asn可以由这种反应形成。 成肽反应: -羧基、-氨基 侧链R基参加的主要反应: -SH的氧化还原;酚基的Millon反应(Tyr+米伦试剂产生红色); Folin一酚反应(Tyr或Trp+磷钼酸 蓝色)等,1.纸层
23、析法:分配系数,2.薄层层析法:定性。原理因所用薄层的原料而不同。用氧化铝等吸附剂则是吸附层析;若用纤维素或硅藻土则属分配层析,3.离子交换柱层析法:电荷,5.纸电泳,四、氨基酸的分离与分析,在蛋白质组成分析、氨基酸顺序分析,水解制备氨基酸或微生物发酵生产氨基酸时要进行氨基酸的分离、分析和纯化。主要根据被分析样品的(如aa混合物)分配系数、所带电荷、分子大小等不同而达到分离的目的 :,4.高效液相层析法:电荷、分配系数,层析按支持物分:,固定相 各组分对固定相,按层析原理分:,分配柱层析,填充物为亲水性的不溶物质如纤维素、 淀粉、硅胶等,收集的组分用茚三酮 显色定量。,纸层析:固定相是液体,吸
24、附在滤纸上,将样品点在纸上, 用流动相展开。,单向纸层析图,Rf值,薄层层析:将有适当粘度的固定相涂在薄板上,离子交换层析,原理:分离氨基酸时,用离子交换树脂作为支持物,利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应,由于各种离子交换能力不同,与树脂结合的牢固程度就不同,在洗脱过程中,各种离子以不同的速度移动,从而达到分离的目的。,pH值增高时,抑制蛋白质阳离子化,随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时,抑制蛋白质阴离子化,随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时,增加盐离子,则降低pH值。当使用阳离子交换剂时,增加盐离子浓度,则升高溶液pH值。,离子交换层析,
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