生物化学 王镜岩版 上.ppt
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1、第七章 蛋白质的分离、纯化与表征,分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度 依据:大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体的亲和性 若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完整,1、蛋白质的理化性质: 酸碱性质、胶体性质与沉淀、颜色反应、变性 2、分离纯化的方法: 盐析、电泳、等电聚焦、层析等,蛋白质与多肽一样,能够发生两性离解,也有等电点。在等电点时,蛋白质的溶解度最小,在电场中不移动。 在不同的pH环境下,蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中,蛋白质粒子带正电荷,在电场中向负极移动;在等电点偏碱性溶液中,蛋白质粒子带负电荷,在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳,1、酸碱性质,可解离基团有末
2、端和侧链 故pI与酸性、碱性氨基酸的数目有关 如胃蛋白酶酸性氨基酸多,等电点偏酸性 有些球蛋白的可解离基团只有变性后才能完全滴定,没有盐类干扰时的等电点叫等离子点,蛋白质分子的颗粒直径已达1-100nm,处于胶体颗粒的范围。因此,蛋白质具有亲水溶胶的性质。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜,因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,2、蛋白质的胶体性质:,蛋白质的胶体性质,布郎运动、丁道尔现象、电泳现象,不能透过半透膜,具有吸附能力,蛋白质溶液稳定的原因: 1)表面形成水膜(水化层) 2)带相同电荷。,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件,
3、将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下,蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,蛋白质的沉淀作用,加高浓度盐类(盐析):加盐使蛋白质沉淀析出。 分段盐析:调节盐浓度,可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白(50%(NH4)2SO4饱和度),清蛋白(饱和(NH4)2SO4)。 2. 加有机溶剂 加重金属盐 加生物碱试剂 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱,称生物碱试剂。,在温和条件下,通过改变溶液的pH或电荷状况,使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中,结构和性质都没有发生变化,在适当的条件下,可以重新溶解形成溶液,所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白
4、质的基本方法,如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,可逆沉淀,在强烈沉淀条件下,不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性,而且也破坏了蛋白质的结构和性质,产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化,所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,不可逆沉淀,一、蛋白质在某些理化因素的作用下,其空间结构受到破坏,从而改变其理化性质,并失去其生物活性,称为蛋白质的变性。,二、变性的实质是破坏了蛋白质的空间结构,并不引起一级结构的改变。,3、蛋白质的变性,蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素,能够破坏蛋
5、白质的结构状态,引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。,在某些物理或化学因素的作用下,蛋白质严格的空间结构被破坏(不包括肽键的断裂),从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变,蛋白质的变性,变性蛋白质通常都是固体状态物质,不溶于水和其它溶剂,也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以,蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。,变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失。溶解度降低,易形成沉淀析出,结晶能力丧失,分子形状改变,肽链松散,反应基团增加,易被酶消化。 变性蛋白质分子互相凝集
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