生物素-亲和素标记技术完整讲解.ppt
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1、生物素-亲和素标记技术 第一组 一 背景 二 原理 三 实验方法及步骤 四 应用 五 反应特点 六 应用前景 一 背景 生物素: 又称维生素H 、辅酶R,是水溶性维生素,也属于维生素B族。 1936年,两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中 分离提取出一种结晶物质,是酵母生长所必需的,称之为“生 物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类和动物 维持健康不可缺少的要素,并因而得名。因其在食物中的分 布很广,几乎每种食物中都含有少量的生物素,加之人体每 日的所需量又很少,所以,人们一般都不缺乏这种维生素。 亲和素: 亲和素是一种糖蛋白,可由蛋清中提取。分子量60kD, 每个
2、分子由4个亚基组成,可以和4个生物素分子亲密结合。 亲和素与生物素的结合,虽不属免疫反应,但特异性强,亲和力大, 两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的 结合位置,可以连接更多的生物素化的分子,形成一种类似晶格的复合体。 因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来,就可大大提高ELISA的敏感度。 卵白亲合素 亲合素 链亲合素 卵黄亲合素 类亲合素等 后两种因其特异性亲合力低,研究不多,前两种目前已深入研究并得到广泛应用。 二 原理 20世纪60年代初发现了生物素(biontin,B)和卵白素(avidin,A), 其亲和力至少比抗原-抗体结合力高百万倍,是目前发现的自然界
3、中 具有最强亲和力的物质。 每个 分子由4个亚基组成,可以和4个生物素分子亲密结合。 亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物 活性,是理想的标记剂。一个抗体分子可偶联数十个生物素或亲和素分子,而亲和素或生物素分子 又可与酶或荧光素结合,从而组成一个生物放大系统,显著提高检测的灵敏度。常用的有亲和素- 生物素标记法(Labeled avidinbiotin,LAB)、亲和素-生物素桥法(bridged avidinbiotin, BAB)和 亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidinbiotinperoxid ase complex,ABC)
4、。 生物素-亲合素系统 (biotin-avidin system,BAS),是70年代后期应用于免疫学,并得到迅速发 展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应,并 与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合,使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步 提高。BAS已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域,既可用于微量抗原、抗体及受体的定量 、定性检测及定位观察研究,亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。 三 实验方法及步骤 生物素-亲和素标记技术的主要方法 : (1)桥-亲和素-生物素标记法(BAB法) (2)亲和素-生物素-过氧
5、化物酶法(ABC法) (3)标记生物素-抗生物素法 ( LAB法) (1)桥-亲和素-生物素标记法(BAB法) 桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique,BAB)分为直 接法和间接法,直接法是以游离的亲和 素(或链霉亲和素)作为桥联剂,利用亲和 素的多价性,将生物素化抗体复合物与 标记生物素(如酶标生物素)联结起来,达 到检测反应分子的目的。间接法则是在 抗原与特异性抗体结合反应后,再用生 物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结 合,从而使灵敏度进一步提高。由于生 物素化抗体分子上连有多个生物素,因 此,最终形成的抗原-生物素化抗体-亲和 素-酶标生
6、物素复合物可积聚大量的酶分 子。加入相应酶作用底物后,会产生强 烈的酶促反应,提高检测灵敏度。Smith K A5利用间接BAB法检测乙型肝炎表面 抗原(HBsAg),其灵敏度比常规ELISA高 1 000多倍。 酶联免疫吸附试验(ELISA)步骤(间接法) 1 包被抗原 2 洗涤 3 待测血清(抗体) 4 洗涤 5 酶标二抗 6 洗涤 7 显示物A、B 8 加终止液 (H2SO4) 酶标板 桥-亲和素-生物素标记(BAB法)步骤 间接法步骤: 1包被抗原 2洗涤 3待测抗体 4洗涤 5生物素标二抗 6洗涤 7加亲和素 8洗涤 9加酶标生物素 10洗涤 11加底物 12显色后加终止液 直接法步
7、骤 (2)亲和素-生物素-过氧化物酶法 (ABC法) 即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology,ABC),其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合,形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物,当其与检测反应体系中的生物素化一抗(直接 法)或生物素化二抗(间接法)相遇时,复合物中未饱和的亲和素( 或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生物 素-过氧化物酶复合物形成时,一个标记了生物素的酶分子可通过其 生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子,一个亲和素(或链霉亲 和素)分子又可
8、桥联多个酶标生物素分子,这样就形成具多级放大作 用的晶格样网状结构,其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡, 方法简单,节约时间,可用于双重或多重免疫染色,尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。 + +ABC B-E + A ABC Ab-Ag-Ab-B + ABC Ab-Ag-Ab-B-ABC 直接法: 直接法 间接法 (3)标记生物素-抗生物素法 标记亲和素-生物素法(labeled avidin-biotin, LAB)直接法是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接 与免疫复合物中的生物素化一抗连接进行酶呈色 反应,间接法是采用生物素化的二抗和抗原结合 ,由于
9、加入了二抗,较直接法检测灵敏度要高, 对免疫细胞中免疫球蛋白的定位具有特异性。 LAB法需以生物素标记一抗,应用不如ABC法普 遍,与ABC法相比,LAB法操作较简单,但灵敏 度较低 四 应用 1 在免疫学中的应用 免疫荧光技术中的应用 免疫放射技术中的应用 胶体金技术中的应用 免疫酶技术中的应用 ELISA中的应用 2 在分子生物学中的应用 3 在组织化学中的应用 4 在分离纯化中的应用(亲和层析) 4.1 在免疫学中的应用 4.1.1 在免疫荧光技术中的应用 BAS应用于免疫荧光分析(fluorescence immunoassay,FIA)技术, 可用荧光素直接标记亲和素(或链霉亲和素)
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