生物细胞:4第四章 微生物细胞的破碎.ppt
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1、第四章 微生物细胞的破碎 知识点:细胞壁的组成和结构,微生物细胞 的破碎技术,破碎率的测定。 重点:工业生产中常用的几种细胞破碎方法 的原理,操作过程及常用设备,并能就实际 生产情况予以合理的选择。 难点:常用破碎方法的合理选用。 为了研究细胞的破碎,提高其破碎率,有必要了解 各种微生物细胞壁的组成和结构(表1): 微生物革兰兰氏阳性细细菌革兰兰氏阴性细细 菌 酵母菌霉菌 壁厚/nm20-8010-13100-300100-250 层层次单层单层多层层多层层多层层 主要组组 成 肽肽聚糖 (40-90%) 多糖 胞壁酸 蛋白质质 脂多糖 (1-4%) 肽肽聚糖 (5-10%) 脂蛋白 脂多糖
2、(11-22%) 磷脂 蛋白质质 葡聚糖 (30-40%) 甘露聚糖 (30%) 蛋白质质 (6-8%) 脂类类 (8.5- 13.5%) 多聚糖 (80-90%) 脂类类 蛋白质质 一、细胞壁的组成和结构 u细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构,网状结 构越致密,破碎的难度越大,革兰氏阴性细菌网状结构不 及革兰氏阳性细菌的坚固; u酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密 程度和它的厚度; u由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构, 其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。 u不同种类的细胞结构差别很大,破碎的难易程度也不同 ,由难到易的大致排列顺序为:植物细胞真菌(如酵母
3、 菌)革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌动物细胞。 二、常用破碎方法 分 类类作 用 机 理适 应应 性 机 械 法 珠磨法固体剪切作用可达较较高破碎率,可较较大规规模操作,大分 子目的产产物易失活,浆浆液分离困难难 高压压匀浆浆 法 液体剪切作用可达较较高破碎率,可大规规模操作,不适合 丝丝状菌和革兰兰氏阳性菌 超声破碎法液体剪切作用对对酵母菌效果较较差,破碎过过程升温剧剧烈, 不适合大规规模操作 X-press法固体剪切作用破碎率高,活性保留率高,对对冷冻冻敏感目 的产产物不适合 非 机 械 法 酶溶法酶分解作用具有高度专专一性,条件温和,浆浆液易分离 ,溶酶价格高,通用性差 化学渗透法改变细变
4、细 胞膜的渗透性具一定选择选择 性,浆浆液易分离,但释释放率较较 低,通用性差 渗透压压法渗透压剧压剧 烈改变变破碎率较较低,常与其他方法结结合使用 冻结冻结 融化 法 反复冻结冻结 -融化破碎率较较低,不适合对对冷冻冻敏感目的产产物 干燥法改变细变细 胞膜渗透性条件变变化剧剧烈,易引起大分子物质质失活 细胞破碎机理图 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化 铝等研磨剂(直径小于1mm)一起快速搅拌或研磨,研磨 剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞,使细胞破碎,释放 出内含物。在珠液分离器的协助下,珠子被滞留在破碎室内 ,浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用 夹套冷却
5、的方式带走。 1.珠磨法(Bead mill) 原理: n实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器; n中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理; n在工业规模中,可采用高速珠磨机(瑞士WAB公司和德 国西门子机械公司制造)。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下:降低能耗、减少大 分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片 不易分离而给后续操作带来的困难。 高速珠磨机 采用高压匀浆器(由高压泵和匀浆阀组成,英国APV公司和美国 Microfluidics公司均有产品出售)。 2.高压匀浆法(High-pressure homogenization) 大规模细
6、胞破碎的常用方法 利用高压使细胞悬浮液通过针形阀,由于突然减压和高速冲 击撞击环使细胞破碎,细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时, 每秒速度高达几百米,高速喷出的浆液又射到静止的撞击环 上,被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动 过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化,从而造成 细胞破碎。 原理: 高压匀浆器 在工业规模的细胞破碎中,对于酵母等难破碎的及高浓度在工业规模的细胞破碎中,对于酵母等难破碎的及高浓度 的细胞,常采用多次循环的操作方法。的细胞,常采用多次循环的操作方法。一般说来,酵母菌一般说来,酵母菌 较细菌难破碎,处于静止状态的细胞较处于快速生长状态较细菌难破碎,处于静止状态
7、的细胞较处于快速生长状态 的细胞难破碎,在复合培养基上培养的细胞比在简单合成的细胞难破碎,在复合培养基上培养的细胞比在简单合成 培养基上培养的细胞较难破碎。培养基上培养的细胞较难破碎。 p易造成堵塞的团状或丝状真菌, p较小的革兰氏阳性菌, p含有包含体的基因工程菌(因包含体坚硬,易损伤匀浆阀) 不宜采用高压匀浆法。 破碎的动力学方程为:ln1(lR)KNP 其中 R破碎率; K与温度有关的速度常数; P一操作压力; N一悬浮液通过匀浆器阀的次数。 与微生物种类有关的常数; 破碎酵母菌,值可取2. 2。可见,影响破碎的主要 因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。 在15-25 kHz的频率下操
8、作。其原理可能与空化现象( cavitation phenomena)引起的冲击波和剪切作用有关。 空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合,从而产生一个极为强烈的 冲击波压力,由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪 切应力,促使细胞液体发生流动,从而使细胞破碎。 3.超声破碎法(Ultrasonication) 一般杆菌比球菌易破碎,G-细菌比G+细菌易破碎,对酵母菌 的效果较差,该法在实验室小规模细胞破碎中常用在实验室小规模细胞破碎中常用。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。 4.酶溶法(Enzymatic Lysis) (1)外加酶法 常用的溶酶 溶菌酶 -1,
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