生物:1.2《基因工程的基本操作程序》课件(新人教版选修3)(4).ppt
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1、 基因工程的基本操作程序 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 1.基因工程的操作步骤正确的操作顺序 是 使目的基因与运载体相结合将目的基因 导入受体细胞检测目的基因的表达是否符 合特定性状要求提取目的基因 A B C D C 步骤一:步骤一:目的基因的获取目的基因的获取 目的基因是人们所目的基因是人们所需要转移需要转移或或改造改造的基因的基因 , , 获取目的基因是实施基因工程的第一步获取目的基因是实施基因工程的第一步 。 如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因,还有植如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因,还有植 物的抗病(抗病毒、抗细菌)基因、种子贮物
2、的抗病(抗病毒、抗细菌)基因、种子贮 藏蛋白的基因,以及人的胰岛素基因、干扰藏蛋白的基因,以及人的胰岛素基因、干扰 素基因等。素基因等。 目的基因的提取方法目的基因的提取方法 人工合成基因人工合成基因 反转录法反转录法 根据已知的氨基酸序列根据已知的氨基酸序列 合成合成DNADNA :鸟枪法:鸟枪法 直接分离基因直接分离基因 从基因文库中获取 基因组文库 cDNA文库 1 . 1 . 鸟枪法(散弹射击法)鸟枪法(散弹射击法) 用限制酶将供体细胞中的用限制酶将供体细胞中的 DNADNA切成许多片段,从中找出切成许多片段,从中找出 含有目的基因含有目的基因. . 用限制酶切断成 许多片段 1 1)
3、反转录法反转录法: 以目的基因转录成的信使以目的基因转录成的信使 RNARNA为模板为模板 反转录成互补的单链反转录成互补的单链DNADNA 在酶的作用下合成双链在酶的作用下合成双链 DNADNA,从而获得所需的基,从而获得所需的基 因因 目的基因的目的基因的mRNAmRNA 单链单链DNA(cDNA)DNA(cDNA) 双链双链DNADNA ( (即目的基因即目的基因) ) 反转录反转录 合成合成 2.人工合成基因法 2 2)根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法 法 : 根据已知蛋白质根据已知蛋白质 的氨基酸序列,推测的氨基酸序列,推测 出相应的信使出相应的信使RN
4、ARNA序序 列,然后按照碱基互列,然后按照碱基互 补配对原则,推测出补配对原则,推测出 它的结构基因的核苷它的结构基因的核苷 酸序列,再通过化学酸序列,再通过化学 方法,以单核苷酸为方法,以单核苷酸为 原料合成目的基因。原料合成目的基因。 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列 mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列 推测推测 推测推测 目的基因目的基因 化学合成化学合成 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点?上述三种目的基因提取的方法有何优缺点? 优点缺点 鸟枪法 反转录法 根据已知氨基酸 合成DNA法 操作简便操作简便 广泛使用广泛使用 工作量大
5、,盲目,分工作量大,盲目,分 离出来的有时并非一离出来的有时并非一 个基因个基因 专一性强专一性强 操作过程麻烦,操作过程麻烦,mRNAmRNA 很不稳定,要求的技很不稳定,要求的技 术条件较高术条件较高 专一性最强专一性最强 仅限于合成核苷酸对仅限于合成核苷酸对 较少的简单基因较少的简单基因 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术?哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术? 1 1)DNADNA序列自动测序仪:序列自动测序仪: 2 2)PCRPCR技术:技术: 对提取出来的基因进对提取出来的基因进 行核苷酸序列分析。行核苷酸序列分析。 使目的基因的片段使目的基因的片段 在短时间内成百万倍在短时
6、间内成百万倍 地扩增。地扩增。 3 3)从基因文库中获取目的基因:)从基因文库中获取目的基因: 基因文库: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入 受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的 不同的基因,称为基因文库(gene library) 基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基 因文库叫做基因组文库. 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基 因文库叫做部分基因文库. 用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内 切酶切割成一个个片段,然后将这些片段随机地连接在某些质 粒或其他载体上,再将它们转移到适当的宿主细胞中,通过细 胞的增
7、殖而构成各个片段的无性繁殖系(克隆),当这些克隆 多到可以包括某种生物的全部基因时,这一批克隆的总体就称 为该种生物的基因文库。这一定义也适用于线粒体DNA和叶 绿体DNA,分别称为某种生物的线粒体基因文库或叶绿体基 因文库。为了有效地保存基因文库,可通过细菌在固体培养基 上繁殖而使包含各个特定DNA片段的细菌增多。通过分子杂 交的方法,可以筛选出包含有所需基因的DNA片段的细菌( 或噬菌体)。经过扩增得到大量这样的细菌(或噬菌体),从 中便可分离出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文库是 分离高等真核生物基因的有效手段,对于基因定位和基因工程 的研究都很有用。 步骤二:步骤二:基因表达载体
8、的构建基因表达载体的构建 1 1)用一定的限制酶切割质粒,使其出现一)用一定的限制酶切割质粒,使其出现一 个切口,露出黏性末端。个切口,露出黏性末端。 2 2)用同一种限制酶切断目的基因,使其产)用同一种限制酶切断目的基因,使其产 生相同的黏性末端。生相同的黏性末端。 3 3)将切下的目的基因片段插入质粒的切口)将切下的目的基因片段插入质粒的切口 处,再加入适量处,再加入适量DNADNA连接酶,形成了一个重连接酶,形成了一个重 组组DNADNA分子(重组质粒)分子(重组质粒) 目的基因与运载体的结合过程,实际目的基因与运载体的结合过程,实际 上是不同来源的上是不同来源的基因重组的过程基因重组的
9、过程。 常用的受体细胞:常用的受体细胞: 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌 、酵母菌和动植物细胞等。、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 步骤三:目的基因导入受体细胞步骤三:目的基因导入受体细胞 直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等 方法。 (1)电击法:借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。 (2)显微注射法:利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注 入宿主细胞。 (3)直接吸收法:把目的基因和宿主细胞混在一起,让其吸收。 (4)基因枪法:
10、在金属微粒上涂一层目的基因,然后发射到宿主 细胞中。 间接导入法常用的载体是质粒、噬菌体、科斯质粒。 (1)质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DNA分子,它能自 我复制,也可整合到细胞染色体DNA中与其一起表达。质粒通常 还含有标记基因,这可以从细胞的表型特征来识别。 (2)噬菌体是一种细菌病毒,其环状双链DNA可以作为目的基 因的载体。 (3)科斯质粒是一种杂种质粒,含有质粒和噬菌体的部分顺序 ,很适合用作真核生物基因的载体。 1.将目的基因导入植物细胞 2.将目的基因导入动物细胞 3.将目的基因导入微生物细胞 大肠杆菌细胞最常用的转化方法是: 首先用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的
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