研究生实验测序引物设计方法介绍及注意事项.ppt
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1、测序引物设计方法介绍及注意事项,一、PCR引物设计方法:,1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。,2.引物长度一般在1530碱基之间。 引物长度(primerlength)常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。,3.引物GC含量在40%60%之间,Tm值最好接近72。 GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下
2、游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(meltingtemperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm值510。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为5580,其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。,4.引物3端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域,引物3端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。,5.引物3端不能选择A,最好选择T。 引物3端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时,即使在错配的情况下,
3、也能有引发链的合成,而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,G和C错配的引发效率介于A、T之间,所以3端最好选择T。,6.碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发(Falsepriming)。降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。,7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的
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