细胞培养中的细部分问题.ppt
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1、细胞培养中的细节问题,基础篇-无菌操作基本技术,1. 实验进行前,无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌,以70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面,并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后,才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株,且即使培养基相同亦不共享培养基,以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后,再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应
2、移出,以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45 角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。,4. 工作人员应注意自身之安全,须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作,并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中,应避免引起aerosol 之产生,小心毒性药品,例如DMSO 及TPA 等,并避免
3、尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目: 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力,定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750),定期更换水槽的水。,基础篇-实验用品,1. 种类 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌,除了玻璃容器与pasteur pipet 外,其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸
4、附,培养容器种类有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等,依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml,均有2 种不同材质,其中polypropylene (PP) 为不透明材质,polystyrene (PS) 为透明材质,可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch,用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware
5、):100 ml, 250 ml,500 ml,1000ml,2. 清洗 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.10.05 N HCl 浸泡数小时,洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶,以高压蒸汽灭菌,洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净,勿加清洁剂清洗。 3. 灭菌 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖,高压蒸汽灭菌121, 15 lb, 20 分钟,置于oven 中烘干。 3.2. 实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌170, 4 小时。 3.3. 液体或是固体废弃物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸,即漂白水) 或是蒸汽高压灭菌121 , 15
6、lb, 20 分钟处理。,基础篇-培养基,1. 液体培养基贮存于4 冰箱,避免光照,实验进行前放在37 水槽中温热。 2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月,期间glutamine 可能会分解,若细胞生长不佳,可以再添加适量glutamine。 3. 粉末培养基配制(以1 升为例): 3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清,因此粉末培养基之配制体积为900 ml,pH 为7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加,若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成pH 之误差,或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合,然后用CO2 气体调整pH,而非用强酸(H
7、Cl)或强碱(NaOH),因为氯离子对细胞生长可能有影响,且贮存时培养基的pH 易发生改变。,3.2. 材料: 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水,水品质非常重要) ,粉末培养基 ,NaHCO3 ,电磁搅拌器 无菌血清瓶 ,0.1 或0.2 mm无菌过滤膜 ,pH 计,真空泵,CO2 气体 3.3. 步骤: 3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中,搅拌使其溶解。 3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末溶于200ml milli-Q 水中,搅拌使其溶解,然后通入CO2 气体至饱和,约3-5 分钟。 3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入
8、溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH 应为7.2-7.4,除非pH 值偏差太大,否则不需用酸碱再调整之。若为太碱,可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时,pH 会升高0.1-0.2。 3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌,同时分装至无菌容器中,标示培养基种类、日期、瓶号等,贮存于4。(血清亦可加入培养基中一起过滤) 3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。,附-配制培养基之生长测试,材料: MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) met
9、hanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013) 步骤: 1. 以待测试培养基培养MDCK cell,接种MDCK 细胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中,每个well 接种1 102 活细胞,同时作对照组实验。 2. 接种57 天后,在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长,待细胞群落大到可以肉眼观察,而群落间不互相接触时即可。 3. 去除培养基,加入1 ml Carnoys 固定液(甲醇:冰醋酸 3:1),室温下静置10 min。 4. 去除固定液,水洗二次。 5. 加入1
10、ml 10 % Giemsa solution,室温下静置染色2-3 min。 6. 去除染液,水洗二次。 7. 以肉眼计数群落数,并比较之,若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳,则丢弃之。,基础篇-抗生素,1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素 1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株,培养基中不加抗生素。 1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株,制作token freeze 前培养基须添加抗生素,待token freeze 通过污染测试后,大量培养时则不加抗生素。 2. 寄送活细胞时,须将培养液充满整个flask 时,则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + stre
11、ptomycin 100 ug/ml)。 3. 若要检测mycoplasma,则培养基内不可添加gentamicin,因gentamicin 会抑制mycoplasma 生长。,4. 去除细菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml,注意混合使用后药物毒性会增强。 5. 抗生素使用种类与浓度: 工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌 penicillin 100 units/ml -20 G(+) bacteria streptomy
12、cin 100 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20 yeast and molds,基础篇-血清,1. 血清必须贮存于20 -70,若
13、存放于4,请勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶,可将4045 ml 分装于无菌50 ml 离心管中,由于血清结冻时体积会增加约10 %, 必须预留此膨胀体积之空间,否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2. 一般厂商提供之血清为无菌,不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物,则可将血清加入培养基内一起过滤,勿直接过滤血清。 3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20或70至4冰箱溶解一天,至室温下全溶后再分装,一般以50 ml 无菌离心管可分装4045 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沈淀的发生。勿直接由20直接至37解冻,因温度改变太
14、大,容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。,4. heat-inactivation 是指56, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须,一般不建议作此热处理,因为会造成沈淀物之显著增多,且会影响血清之品质。补体参与之反应有:cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and a
15、ctivation of lymphocytic and macrophage cell type。 5. 勿将血清置于37太久,若在37放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏,而影响血清之品质。,6. 血清之沈淀物 6.1. 凝絮物:发生之原因有许多种,但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成,这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物,可用离心3000 rpm, 5 min 去除,或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物,因为会阻塞过滤
16、膜。 6.2. 显微镜下观察之“小黑点”:通常经过热处理之血清,沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”,常会误认为血清遭受污染,而将血清放在37中欲培养此“微生物“,但在37环境下,又会使此沈淀物增多,更会误认为微生物之增殖,但以培养细菌之培养基检测,又没有污染。一般而言,此小黑点应不会影响细胞之生长,但若怀疑此血清之品质,应立即停用,更换另一批号的血清。,附-血清之生长测试,材料: MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL
17、12000-022 ) 6-well TC plate (or 35mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013) 步骤: 1. 以a-MEM with 10 % FBS (已测试过) 培养MDCK 细胞于T75 flask 至80% confluency。 2. 以trypsin-EDTA 处理细胞,离心后,加入适量不加血清之a-MEM 制成细胞悬浮液,并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM 稀释细胞浓度为1102活细胞数/ ml。 3. 将1 ml 细胞悬浮液接种入6-well
18、 plate 中,并另加入1 ml 含不同浓度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM,使血清最终浓度为10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已测试过之血清同时进行对照组试验。,4. 37 oC,5 % CO2 培养箱培养5-7 天,期间不需更换培养基,待细胞群落大到可以肉眼观察,而群落间不互相接触即可。 5. 去除培养基,加入1 ml Carnoys 固定液(甲醇:冰醋酸 3:1),室温下静置10 min。 6. 去除固定液,水洗二次。 7. 加入1 ml 10 % Giemsa solutio
19、n,室温下静置染色2-3 min。 8. 去除染液,水洗二次。 9. 以肉眼计数群落数 10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency ): SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 % 11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency): SPE = total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) x100 % 比较各浓度血清培养基之RPE,即可得知待测血清对细胞生长的影响。订购多量同一批号的优良
20、血清,置于70 保存之,基础篇-细胞传代培养,1. 细胞生长至高密度时,即须分殖至新的培养瓶中,一般稀释比例为1:3 至1:6,依细胞种类而异。 2. 材料: 2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbeccos phosphate-buffered saline, Ca+/Mg+ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062): 以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中,保存于20,使用前放在37 水槽回温。 2.3.
21、 新鲜培养基 2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 3. 步骤: 3.1. 附着型胞(adherent cell) 3.1.1. 吸掉旧培养液。 3.1.2. 用D-PBS 洗涤细胞一至二次。,3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2),37 作用数分钟,于倒立显微镜下观察,当细胞将要分离而呈现圆粒状时,吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA,则在trypsin-EDTA 作用后,加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin 作用,离心后再吸掉上清液。) 3.1.4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落,加入适量之新鲜培养
22、基,以吸管上下吸放数次以打散细胞团块,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常培养条件培养。,3.2. 悬浮型细胞(suspension cell) 3.2.1. 吸出细胞培养液,放入离心管中,离心1000 rpm 5 分钟。 3.2.2. 吸掉上清液,加入适量之新鲜培养基,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常培养条件培养。 3.3. 融合瘤(hybridoma) 3.3.1. 有些hybridoma cell 需培养三天以上才会产生抗体,若是更换培养基,则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基,直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大,可倾斜放置,或分殖至
23、新培养瓶中。,基础篇-细胞冷冻保存 (一),1. 注意事项: 1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态,约为80 90 致密度。 1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22 micronFGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以510 ml 小体积分装,4避光保存,勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长
24、期储存后对细胞会有毒性。 1.4. 冷冻保存之细胞浓度:,1.4.1. normal human fibroblast: 13 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 13 x 106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 57 x 106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度,而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 510 x 106cells/ml,
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- 细胞培养 中的 细部 问题
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