细菌分离与鉴定方.ppt
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1、细菌分离与鉴定方法 嗜水气单胞菌分离鉴定,分离方法 细菌的生长状况观察 氧化酶试验 AHM鉴别培养 吲哚试验 革兰氏染色法 糖发酵试验 脱脂奶平板试验(酪蛋白胨化试验),分离方法,用途: 在检查含两种或两种以上的待检材料(如肝、脾、肾、心、肌肉等)中的某种细菌时,须先将待检材料进行分离培养。常用的分离培养方法是琼脂平皿分区划线法,是借划线将混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来,使个别的细菌能固定在某一点,经培养生长繁殖后形成单个菌落,以达到分离获得纯种细菌的目的。,分离方法,具体操作方法如下: 点燃酒精灯,右手执笔式握持接种环(见图1),在酒精灯火焰上烧灼接种环,待冷,取待测菌液一环。 左手抓握琼
2、脂培养基平皿,用手掌将平皿的底固定,用手指将平皿的盖略抬起一些,进行接种(见图2)。或者,将平皿的盖留在实验台上,尽量直立平皿靠近酒精灯火焰,右手持接种环在琼脂表面的一端(即1区,约占整个平皿的1/61/5)涂布,划线时,接种环与琼脂表面呈 3040的角度轻轻接触,利用腕力动作,切忌划破琼脂表面。烧灼接种环,待冷后,将接种环通过1区划线数次,在2区作连续划线,各线条间隔要小,但不能重叠。划满平皿的1/51/4区域,划完2区不需烧灼接种环,继续通过2区数次,在3区作连续划线,如此反复至划完整个平皿(如图3)。,图1 接种环的握持方法,图2 平皿的握持方法,分离方法,接种完毕,盖好平皿盖,在平皿底
3、玻璃上用记号笔注明标本名称、接种时间、接种者等。然后将平皿的底朝上,放置在37孵箱内孵育24h。 取出后观察琼脂表面的菌落分布情况(见图3),注意观察最后12区内是否分离出单个菌落,并观察记录菌落特征(如菌落大小、形状、透明度、色素等情况)。,烂鳃病病原菌平板划线分离: 取病鱼鳃丝一小块,置于滴有无菌水的载玻片的边缘,10分钟,用接种环蘸水,在胰胨琼脂培养基上划线。 肠炎病病原菌划线分离: 用70%酒精棉球擦拭鱼体,无菌条件下,取病鱼的肝或脾或肾或心于普通营养琼脂基划线分离。 赤皮病病原菌划线分离: 用刀片刮除病灶腐烂部分后用接种环挂取病料,在普通营养琼脂培养基上平板划线。28培养24h。,细
4、菌的生长状况观察,原理 细菌于适宜条件下在不同的培养基上生长,其生长状态不同。不同细菌在同一种培养基中生长,生长特点也不相同。这些区别称之为培养特征,是鉴别细菌和细菌分类的依据之一。 把细菌接种在固体培养基上,在适宜的条件下经过一定时间的培养,在培养基表面(或内部)形成肉眼可见的有一个细菌大量繁殖后而成的集团,称之为菌落。不同细菌的菌落大小、光浊度、色泽均有其特征。,普通琼脂平板 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g 氯化氯化钠(NaCL) 5.0g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000mL 混匀,加热溶解,调PH至7.6分装,112kPa高压灭菌15min
5、,冷却至45倾注灭菌平板。直径90cm平皿每皿倾入1520ml培养基,培养基过少,划线分离时细菌的营养较少,菌落生长过小,菌落形态不易观察,培养基也易于干燥,不易在数天内对菌落形态进行观察。,含糖培养基灭菌条件115,1015分钟 一般培养基灭菌条件121,1520分钟,细菌的生长状况观察,在无菌平皿中,倒入溶化后50普通营养琼脂培养基,每皿约 20毫升,水平静置待凝固。用接种环挑去待分离菌株分区划线,28培养24h。 菌落形态观察: 大小:以毫米计。 形状:圆形、不规则形、放射状等。 表面:光滑、粗糙、圆环状、乳突状等。 边缘:整齐、波形、锯齿状等。 色素:有颜色,颜色,是否可溶等。 透明度
6、:透明、半透明、不透明。 嗜水气单胞菌菌落为光滑、微凸、圆整、无色或淡黄色,有特殊芳香气味。,氧化酶试验,原理 氧化酶亦即细胞色素氧化酶,为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶,系由细胞色素a和a3所组成,一般仅存于需氧菌和兼性厌氧菌中,它使细菌能利用氧作为氢的最终受体,使分子氧还原为过氧化氢,过氧化氢的积累会有毒性,固本试验的阳性菌,不仅需氧而且能产生过氧化氢酶。氧化酶并不是直接与试剂起反应,而是先使细胞色素c氧化,然后此氧化型细胞色素c再使对苯二胺氧化,产生颜色反应,因而本试验实际也是测定细胞色素c是否存在。,氧化酶试验,试剂 1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液或1%二盐酸四甲基对苯二胺水溶液。 方法
7、 在干净的培养皿中放一张滤纸,滴上二甲基对本二胺的1%水溶液,仅使滤纸湿润即可,不可过湿。用白金丝接种环(不可用镍铬丝)取1824小时的菌苔,涂抹在湿润的滤纸上,在10s内涂抹菌苔现红色者这为阳性,(四甲基对本二胺呈蓝色),1060s现红色者为延迟反应,60s以上现红色者不计,按阴性处理。 嗜水气单胞菌为阳性。,氧化酶试验,注意事项 二甲基对本二胺溶液易于氧化,一般于冰箱中储存两周。如溶液颜色转红褐色,则不宜使用。 铁、镍等金属可催化二甲基对苯二胺呈红色,故不宜用以上材料取菌苔。如无白金丝,可用玻棒或灭菌牙签取菌苔涂抹。 在滤纸上滴加试液已刚刚湿润为宜。如滤纸过湿,妨碍空气与菌苔接触,延长显色
8、时间,造成假阴性。,AHM鉴别培养 AHM为Aeromonas Hydrophila Medium 的缩写。 用于可疑气单胞菌菌落的鉴定。,AHM鉴别培养基 成分 蛋白胨 5.0g 酵母提取物 3.0g 胰蛋白胨 10.0g L-盐酸鸟氨酸 5.0g 甘露醇 1.0g 肌醇 10.0g 硫代硫酸钠(Na2S2O35H2O) 0.4g 枸椽酸铁胺 0.5g 溴甲酚紫 0.02g 琼脂 3.0g 蒸馏水 1000mL 制法 将各种成分(除溴甲酚紫外)溶化于1升水中,调pH6.7,加入溴甲酚紫,混匀煮沸。分装于13100mm试管,每管 5.0ml,于121,灭菌15分钟。(溴甲酚紫的有效pH范围5.
9、26.8,颜色变化:黄紫),AHM鉴别培养,方法 以接种针挑取可疑菌落,穿刺接种达于管底,置352培养1824h,如反应不肯定,可继续培养1824h。 气单胞菌典型反应为培养基管底部为变黄,在接近于试管顶部有紫色带出现。此表明反因为甘露醇阳性,肌醇阴性,鸟氨酸脱羧酶阴性(鸟氨酸脱羧产生腐胺,可使培养基由酸变碱)。有时仅在试管顶端部有轻微变黑,此表明是因分解半胱氨酸产生硫化氢所致。沿穿刺线全部呈混浊状,表明该菌具有动力。,吲哚试验,原理 细菌分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚(靛基质),经与试剂中的 对二甲基氨基苯甲醛作用,生成玫瑰吲哚而呈红色。 培养基 1%蛋白胨水水溶液:调pH7.27.6,分装
10、于1/31/4试管,115蒸汽灭菌30分钟。 Kovacs 试剂 对二甲基氨基苯甲醛 5.0g 戊醇 75g(ml) 浓盐酸 25ml,吲哚试验,方法 将新鲜的菌种接种与上述培养基中,28培养24 h。沿管壁缓缓加入35mm高的Kovacs试剂于培养液表面,在液层界面发生红色,即为阳性反应。若颜色不明显,可加45滴乙醚至培养基,摇动,使乙醚分散于液体中,将培养液静置片刻,待乙醚浮至液面后,在加吲哚试剂。如培养液中有吲哚时,吲哚可被提取在乙醚层中,浓缩的吲哚和试剂反应,则颜色明显。 嗜水气单胞菌吲哚试验阳性,革兰氏染色法,由丹麦病理学家Christain Gram创立,用于细菌分类学研究。 革兰
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- 细菌 分离 鉴定
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