益气活血药对心肌组织及H9C2细胞Cx43表达和凋亡的影响.ppt
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1、益气活血药对心肌组织及H9C2细胞Cx43表达和凋亡的影响,吴爱明,娄利霞,高永红, 张冬梅,朱海燕,王硕仁 北京中医药大学东直门医院 中医内科学教育部和北京市重点实验室,2,主要内容,3,研究背景,心肌缝隙连接蛋白43,心肌细胞凋亡,心血管系统疾病是危害人类健康的常见病。心肌缝隙连接蛋白43和细胞凋亡的异常在心血管疾病的发病过程中都扮演了重要角色。,4,心肌缝隙连接蛋白43(CX43),缝隙连接是一种特殊膜结构,由两个连接子对接而成,每个连接子包含来自毗邻细胞的六个连接蛋白,直接连接两个细胞的胞质,允许相邻细胞间电信号和化学信号的直接通讯。连接蛋白家族有20多个成员,就心室而言,表达最丰富的
2、是Cx43。,5,Cx43是维持心肌细胞间化学偶联和电偶连的关键结构,心肌缺血时,Cx43分布和表达异常会导致心肌细胞电偶联的缺失,易于发生室性心律失常甚至猝死 。 并且Cx43的异常还会导致心肌细胞间的代谢障碍。,6,心肌细胞凋亡,细胞凋亡又称程序性细胞死亡,是一种生理现象,但病理状态下细胞凋亡的增加与心肌缺血、缺血再灌注损伤和心力衰竭的发生都密切相关。,过度的细胞凋亡会加速心肌细胞的丢失,造成心功能的恶化,并促进心室重构的发生和发展。,7,材料与方法,8,实验材料,实验动物 雄性SD大鼠,体重200240g,许可号:SCXK(京)2006-0009。 实验细胞 Rat H9C2心肌细胞系(
3、ATCC Number:CRL-1446) 实验用药 生脉注射液(红参、麦冬、五味子),10ml/支,雅安三九药业有限公司(批号:100301) 血塞通注射液(三七总皂苷),250mg/10ml/支,昆明制药集团股份有限公司(批号:10DL04)。 主要试剂 兔抗Cx43多克隆抗体(批号:10440704) Hoechst凋亡细胞核和凋亡小体染色试剂盒 (#C1100),9,实验方法,10,整体实验分组与给药方法,大鼠随机分为: 益气活血组:生脉注射液联合血塞通注射液 卡托普利组:卡托普利 模型组:生理盐水 假手术组:生理盐水 连续给药一个月,11,心肌梗死大鼠模型制备,参照文献,采用冠脉结扎
4、法制作大鼠心肌梗死模型。 王硕仁,王振涛,赵明镜,李敏.心气虚病证动物模型及其评价体系的构建.中国实验动物学报.2002;10(1): 33-38.,12,心梗模型大鼠心电图和心脏超声评价,结扎冠脉前 结扎冠脉后,模型组 心功能比较,采用心电图和心脏超声评价心梗大鼠造模是否成功。 术后与术前比较,大鼠心电图ST段明显抬高。 取材前超声检查显示模型大鼠左心室内径明显扩大,室壁变薄,收缩运动减弱,心功能降低。,13,在体电刺激诱发室颤实验方法,参照文献,大鼠麻醉后固定,呼吸机辅助呼吸,开胸暴露心脏,连接刺激电极。 采用程控电刺激诱发室颤,记录室颤阈值。 柴松波,王硕仁,姚立芳,等.参松养心胶囊对大
5、鼠心梗后心肌重构和和室颤阈值影响的研究.中国中药杂志.2009,34(16):2101-2104,14,细胞实验分组与给药方法,正常对照组 模型组 血塞通低剂量组 血塞通高剂量组,细胞实验以大鼠H9C2心肌细胞系为研究对象,分为两个实验。 实验1:生脉联合血塞通注射液对H9C2细胞Cx43损伤的影响 实验2:生脉联合血塞通注射液对H9C2细胞凋亡的影响 两个实验均分为以下八组,生脉低剂量组 生脉高剂量组 生脉和血塞通低剂量组 生脉和血塞通高剂量组,15,细胞实验1:诱导H9C2细胞Cx43损伤的方法,参照文献,采用TPA造成Cx43的损伤 。 TPA是一种蛋白激酶C的激活剂,可以增加Cx43的
6、磷酸化,从而降低Cx43通道的通透性,还能显著地降低缝隙连接的组装,并使Cx43失去稳定性。 Lampe PD, TenBroek EM, Burt JM, et al. Phosphorylation of connexin43 on serine368 by protein kinase C regulates gap junctional communicationJ. J Cell Biol, 2000, 149(7): 1503-1512. Lampe PD,Lau AF. The effects of connexin phosphorylation on gap junction
7、al communicationJ. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(7): 1171-1186.,16,细胞实验1:H9C2细胞Cx43检测方法,采用免疫细胞化学法检测Cx43的表达 主要步骤:用4%多聚甲醛固定细胞15min,血清封闭,滴加1:100稀释一抗4孵育过夜。次日加二抗,37孵育30min,DAB显色,倒置显微镜拍照观察。,17,细胞实验2:诱导H9C2细胞凋亡的方法,参照文献,使用Ang诱导心肌细胞凋亡 。 血管紧张素(Ang)是一种生物活性物质,可使血管收缩,血压升高,并能够诱导心肌细胞的凋亡。 裴兆辉,马虹,朱妙章等.血管紧张素诱导心肌细
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