肿瘤细胞培养技术-林星石.ppt
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1、肿 瘤 细 胞 培 养 技 术 解放军总医院免疫室 林星石研究员,Histroy,肿瘤类型:间充质 上皮 神经外胚层 造血源性(1955-1958-1963-1965) In vitro: 原代 传代 建系(1967-1970) 配基成分:纯血清 含血清 无血清 生物学特性:细胞 亚细胞 酶和分子,肿瘤细胞in vitro的特点,细胞保持永生性:自我复制 形态学:大小不一 逐渐一致 增殖力更强:DNA合成期、分裂期达50% 突变性:不同于正常细胞,失去稳定的控制高分化 变低分化 表面性状:负电荷数量正常,贴壁性,抗原性可 变异 接触抑制减弱或消失: 悬浮生长特征: 成瘤性:移植到动物体内可成瘤
2、,肿瘤细胞in vitro 培基,RPMI1640:最常用,+1020%FCS,上皮性 或悬浮性(+0.03%谷氨酰胺) DMEM:常用 F12: 适用于上皮性癌,如肝癌, L-15: 注意:+2g/L NaHco3 或 +20mmol/L HEPESpH7.2 RPMI1640+F12或L-15(1:1):适用肉瘤,培养液特殊添加剂,常用的促细胞生长因子及使用的终浓度 添加剂 终浓度 添加剂 终浓度 BSA 10-5mol/ml EGF 5ng/ml transferrin 5-10 g/ml FGF 5ng/ml insulin 5 pg/ml NGF 5ng/ml 氢化可的松 10-5m
3、ol/ml,肿瘤细胞的培养,与常规细胞培养技术相同 一个细胞群体,存在多种亚群,复杂性 建株细胞较正常细胞易于培养,细胞分裂增殖的调控 (细胞周期),多种基因的协同作用 调控因子: 基因:Cdc2、 cyclin 蛋白磷酸化 蛋白激酶的调控 胸苷激酶的调控 负调:DNA损伤与DNA修复:抑制抗性 肿瘤细胞,细胞间的相互影响,不同亚群代表不同分化程度的细胞群 表型、形态、受体、对因子的反应等 均不同 不同亚群释放不同的正负调节因子 (阴阳调控),细胞因子与激素对肿瘤细胞的调控,一个重要而复杂的因素 因素 高分化 低分化 胰岛素 生长 - 凝血孝素 生长 - 前列腺素 促进(400) 抑制 激情素
4、 - 助黏附 维生素A 抑制生长及分化 _ 调整培基中的成分可调控细胞的生长与分化,影响培养肿瘤细胞生长的因素,PH 营养:如血清效价低 细胞生长因子的自分泌及旁分泌 癌基因抑癌基因的变化 排泄废物的影响 细胞外基质的作用 细胞相互间的作用 污染,培养技术 - 取材,手术标本 活检标本 胸腹水穿刺 细针头穿刺 内窥镜活检 关键:新鲜、无菌、及时、准确,技术- 分离纯化,分离:剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等 密度沉降分离 纯化:反复贴壁去除成纤维细胞 自然淘汰去除正常细胞 利用特异抗原标志筛选法( panning) 分亚型 流式细胞仪分选 克隆建株 高转移株的建立:反复接种,技术-
5、培养,原代培养:去除纤维细胞及淋巴细胞, 防止细菌、真菌污染。 传代培养:增殖力低的细胞需要饲养 细胞适当密度, 基本长满后 传代, 前10代不稳定,注意 培养条件,适当调整培基。,技术- 鉴定与建株,鉴定:组织来源 、形态特征、核型染色体分析、生长特性、对细胞因子的反应(TNF)、集落形成、致瘤实验(裸小鼠) 建株:生长半年以上,病理诊断、光镜及电镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、致瘤及转移情况 注意:不是每一肿瘤组织都能建株,应用- 肿瘤治疗的研究,治疗药物敏感性的鉴定与筛选 肿瘤的多药耐药性的鉴定 各种新药治疗的实验研究 体外:肿瘤的生长(3HTdr掺入) 肿瘤的杀伤率(MTT、5
6、1Cr释放) 体内:裸鼠或免疫功能抑制鼠,成瘤率、抑瘤 生长率、转移率、生存时间及死亡率 作用机理的研究:基因、蛋白、酶、标志、受体,肿瘤细胞培养的应用,肿瘤细胞的遗传特性:各种癌基因及抑癌基因的分析、染色体定位(FISH法) 肿瘤细胞的生物学行为:细胞周期(FACS)、信号传递 肿瘤细胞的标志与激素、受体变化(免疫细胞化学、放射自显影、酶免疫、荧光免疫、放射免疫、免疫印迹),单克隆抗体的制备,单克隆抗体的制备, 基本原理:Bunet抗体选择学说,每个B细胞只能够产生一种针对它的特异性抗原决定簇的抗体。从一个祖先B细胞分裂繁殖形成的纯细胞系,称为克隆。,单克隆抗体的制备, 单克隆抗体定义:来自
7、克隆系的细胞基因完全相同,产生的抗体完全相同。这种从一株克隆系产生的抗体 单克隆抗体(McAb)。 1975年Kohler 和 Milstein 首先利用细胞融合技术制备了永久分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。,单克隆抗体的制备,特点:肿瘤细胞易体外培养和长期生长; B淋巴细胞 分泌特异性抗体; 二者杂交融合杂交瘤,继承二者性质。 HAT培基:H次黄嘌呤、 A氨基蝶呤 T胸腺嘧啶核苷,单克隆抗体的制备,肿瘤细胞DNA合成途径: 叶酸衍生物 氨基酸、小分子化合物合成DNA HGPRT -TK 次黄鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 胸腺嘧啶核苷激酶 核苷酸前体,单克隆抗体的制备,HAT特点:“A” 叶酸拮抗物 骨
8、髓瘤-骨髓瘤:DNA合成途径阻断;缺HGPRT, 不能利用“H”死亡。 脾细胞-脾细胞:有HGPRT,缺增殖能力死亡。 骨髓瘤-脾细胞:HGPRT+无限增殖能力 存活。,单克隆抗体的制备方法,抗原:纯度、分子量。 1. 细胞12107 2. 可溶性蛋白质抗原10 100 g 动物:BALB/C鼠,周龄:68周,雌性 佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、脂质体,免 疫 方 法,1.常规免疫:腹腔或颈部多点皮下 0 天:基础免疫抗原+完全佐剂 15天:基础免疫抗原+不完全佐剂 30天:基础免疫抗原+不完全佐剂 45天:追加免疫同量抗原 48天:进行细胞融合,免 疫 方 法,备注: 1. 细胞、细菌
9、、病毒等颗粒性抗原有较强抗原性,可不加佐剂,直接腹腔注射。 2. 可溶性蛋白质抗原需加佐剂。 本研究室经验:,免 疫 方 法,2. 脾内免疫: 2.1 0 天:基础免疫 15 天:脾内免疫 18 天:细胞融合 2.2 0 天:脾内免疫 4 天:细胞融合,免 疫 方 法,脾内免疫 优点:时间短,使用抗原量少。 可溶性抗原:210g 细胞抗原:1 105 缺点:效果差于常规免疫,尤其无基础免 疫的脾内免疫。,免 疫 方 法,脾内免疫方法: BALB/C小鼠乙醚麻醉,右卧位,消 毒,无菌操作剪开皮肤,透过腹膜,用 4 号针头注射器注入脾脏,尽量刺深,勿刺 透,纵轴方向,边退边注射或多点注射。 注意事
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