遗传病分析4基因组DNA提取与PCR扩增技术.ppt
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1、遗传病的分析4 基因组DNA提取与PCR扩增技术,一、基因组DNA提取,实验目的,基因组DNA的制备是基因分析的前提。 本实验要求掌握基因组DNA提取的基本方法。,原 理,DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的。核酸与蛋白质之间的结合力包括离子键、氢键、范德华力等,破坏或降低这些结合力就可把核酸与蛋白分开。 DNA、RNA所含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性质,吸收高峰在260nm处,所以,可用紫外分光光度法测定DNA的浓度。,原理,基因组DNA提取试剂盒:在高盐的状态下,DNA纯化树脂专一性地吸附DNA;而在低盐或水溶液状态下,DNA被洗脱下来。,器材与试剂,台式高速
2、离心机、天平、水浴恒温箱、移液枪、塑料离心管等 试剂盒(纯化树脂、GN结合液、漂洗液、无水乙醇、离心纯化柱 )、TE缓冲液,操作,1、将全血轻轻混匀,转移0.5ml全血到1ml纯化树脂中,颠倒混匀5-6次,室温,3min。其间要颠倒混匀1次,5000r/min离心3sec; 2、取沉淀,加1mlGN结合液悬浮沉淀,颠倒混匀, 5000r/min离心3sec; 3、取沉淀,加0.5ml漂洗液纯化树脂2次,颠倒混匀, 5000r/min离心3ecs; 4、取沉淀, 加0.8ml无水乙醇悬浮沉淀,颠倒混匀;装入离心纯化柱,12000r/min离心1min,弃乙醇液; 5、空柱再12000r/min离
3、心1min,进一步弃乙醇液; 6、取离心好的纯化柱套入一干净的1.5ml离心管中,加入100ul TE缓冲液于纯化树脂上(不能粘在管壁上),室温下放置3min,12000r/min离心2min。,注意事项,一般情况下,纯净的DNA OD260/OD280比值约为1.8,RNA为2.0。若样品中含蛋白质,则比值下降,必要时需重新抽提。若DNA的比值1.75,则加入SDS至0.5%; 从核酸中去除蛋白质时,常用到酚:氯仿等体积混合液。氯仿的作用是使蛋白质变性并有助于水相和有机相的分离; DNA用TE溶解,可增加DNA的稳定性,便于长期保存。,二、PCR扩增技术,实验原理,多聚酶链反应(PCR)技术
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