重组门冬酰胺酶制备表达纯化.ppt
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1、酶类药物 -重组门冬酰胺酶表达和制备,酶的分类,门冬酰胺酶,L -天门冬酰胺酶 AnsB 能催化天门冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨。淋巴瘤和白血病细胞通常不能合成天门冬酸胺,L -天门冬酸胺酶将阻止癌细胞蛋白质合成而导致癌细胞死亡。在临床上,L -天门冬酰胺酶已广泛用于治疗白血病和淋巴瘤。但目前国内尚不能生产,国外也仅有低产酶能力的大肠杆菌野生株产品,生产成本高,药价昂贵。基因工程菌产品既能填补国内空白,又能大幅度降低生产成本。,参 考 文 献,1-重组与表达 刘景晶,李晶,吴梧桐,胡梅清.大肠杆菌L-天门冬酰胺酶基因的高效表达 中国药科大学生物化学教研室, 南京210009南京铁道医学院生物化学
2、教研室, 南京210009 2-提取与纯化 刘景晶,金健勤,戴海滨,吴梧桐.大肠杆菌L门冬酸胺酶的提取和纯化中国药科大学生化教研室, 南京210009,重组与表达,材料 限制酶 Ncol 、Hind III及T 4 DNA 连接酶,购自 Promega 公司;Taq 酶、dNTP 、IPTG 购自华美公司;丙烯酰胺、N , N -甲叉双丙烯酰胺、SDS购自sigma 公司。pKK 233 -2 购自clonetech 公司;pKK 233 - ansB 是将代PCR 扩增得到的AnsB 基因DNA 用 Ncol 和Hind III消化后,定向插入pKK 233 -2 的多克隆位点而得到的重组质
3、粒。,实 验 方 法,PCR扩增AnsB基因 重组质粒PKK233-ansB 的构建 阳性转化子的筛选,PCR扩增AnsB基因,模板的制备:用接种环挑取CPU 210009菌体少许,在裂解液(1TritonX-100,2mmol/LTris-HCl pH8.5 ,2mmol/L EDTA)1ml中振散,95C加热处理液10min,吸取处理液5ul用于PCR。 引物:E1: 5-GGCCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCACITGC 一3 E2: 5-GGAAGCTTGAGAATGCCGTGATAC 一3 11:5-GGCCATGGAGT111TCAAAAAGACGCACTTGC一3
4、 12 : 5-GGAAGCTTAGACTGATTGAAGATCTGCTGG 一3 扩增条件:84C变性1 min ; 60C复性2 min ; 72C延伸1 min ;循环28次。,重组质粒PKK233-ansB 的构建,PcR 扩增后的DNA片段及质粒pKK 233 -2 同时分别用限制酶Ncol 和Hindl 消化并用琼脂搪凝胶电泳分离和回收质粒大片段;将消化后的DNA 片段和电泳回收的质粒大片段用T 4.DNA 连接酶连接,连接产物经琼脂糖凝胶电泳回收后转化HB 1 01 、71 / 15 、ATCc 9637 、JM107 、cPU 210009 ,筛选获得相应的阳性转化子。,阳性转
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