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1、镇痛药理研究实验方法 周玖瑶 药理学教研室 疼痛的生理、病理和药学 当代疼痛学之所以能够发展,最重要的是 得益于外周和中枢神经系统结构与功能可 塑性变化概念的引入,从分子到脑功能全 面地揭示病理痛信息跨突触、跨膜和胞内 信号转导机制奠定了理论基础,为临床寻 找高效、低毒、全安的镇痛药提供了导向 。 镇痛发展简史回顾 (一) 中医对痛的认识 痛为临床的常见症状,是疾病发展到一定 时期的表现,又是人体神经抗御外邪自护 自调的一种反应,身体的某一部受损,最 终表现疼痛。 中医理论认为, “不通则痛”和“不荣则痛”则 是一切疼痛发生的病理基础。 中医理论认为:“诸病皆因于气”。即一切痛 的产生都由于气
2、机被干扰 素问举痛论云:“经脉流行不止,环周 不休。寒气入经则稽迟,泣而不行,客于 脉外则血少,客于脉中则气不通,故卒然 而痛”。 不通则痛”具体的病因病机又可与下面因素 有关。 寒邪凝滞,阳气不达,气血不畅,经气 闭阻则可致疼痛的发生。 内经认为“寒邪入经二稽迟,泣而不行 ,客于脉中则气不通,故卒然而痛脉寒则 缩卷,缩卷则绌急,则外引小络,故卒然 而痛.”,疼痛或缓或急,常有冷感,痛有 定处,得温痛减,或喜按,遇寒加剧 瘀血内阻每致络脉不通,不通则痛。 津不生血反为滞更加阻滞气运行与生成, 形成肿胀而痛,气血瘀滞,脉搏道失荣, 真气难通,瘀血阻碍滞,脏虚腹实,气血 运行失常其常规,久病入络,
3、血液污秽, 成毒败血,损伤脉络而痛。 痛如针刺,痛有定处,拒按,夜间痛甚。 气机郁滞而致的疼痛。疼痛性质多为胀 痛,痛无定处,遇情志刺激加重。 热毒内蕴,腑气不通,六腑以通为用, 以降为顺,如腑气通降失常,梗阻不通则 产生疼痛,痛势较剧,呈热痛,得冷稍减 。 痰浊阻滞脏腑经络或结聚四肢百骸,经 气不利而致的痛,疼痛多为钝痛、隐痛、 胀痛、木痛等。 “不荣则痛” 正气不足,气血津液亏虚,脏腑经络失养 而致“不荣则痛”。 素问举痛论:“寒气客于五藏,厥逆上 泄,阴气竭,阳气未入,故卒然而痛”。 灵枢阴阳二十五人:“血气皆少则喜转 筋,踵下痛”。 灵枢五癃津液别:“阴阳不和,则使液溢而下 流于阴,髓
4、液皆减而下,下过度则虚,虚故腰背痛 而胫酸。”明确提出了虚可致痛的观点。 卫生宝鉴:“清阳之气愈亏损,不能上荣.所以 头苦痛”。 质疑录:“肝血不足则为筋挛.为目眩,为头痛 ,为胁肋痛。为少腹痛,为疝痛诸证,凡此皆肝血 不荣也”。一般而言,虚证常有寒化或热化之趋势, 故除疼痛外,尚可兼有虚热或虚寒的相应征象。“不 荣则痛”表现为隐隐作痛,绵绵不休,疲劳即剧,时 作时止。 中医理论认为,心主神明。 疼痛是一种感觉,一切疼痛又必须在“神”的 参与下才能产生。 素问灵台秘典论云:“心者,君主之官 ,神明出焉。” 灵枢本神云:“所以任物者谓之心”。 内经强调:“刺肉无伤脉,脉伤则内动 心”。 疼痛的定
5、义 国际疼痛学会(International Association for the Study of Pain, IASP) “疼痛是与实际或潜在的组织损伤相关联的不 愉快的感觉和情感体验,或用组织损伤这类词 汇所描述的主诉症状”,“无交流能力决不能否定 一个个体正有痛体验和需要适当缓解疼痛治疗 的可能性”。 疼痛应包括“痛知觉”(pain perception),和“ 难受的”(unpleasant)的情感反应。包 含机体内在的主观的、个人的、多维的体验, 它涉及心理、行为、情感、认知和感觉等内容 。 疼痛的的生物学息义 疼痛是所有动物共有的感觉,并与人感觉相似。疼痛也是 每个人一生中体验
6、最早、最多的主观感觉,像一把峰刃的 双面刀,是机体和内脏受到伤害性刺激、侵害的保护性 警报信号。 生理性疼痛是生存必需的警报系统 病理性疼痛是妨碍生存的一种疾病,它提醒患者需要医疗 帮助,去看医生,获得治疗,早期治疗有助于急性疾病和 组织损伤保持稳态,启动复杂的体液反应,避免病变化过 度或过分延长,减少患者死亡率,从而使人们躲避危险、 确保人体健康。 因此,疼痛是作为保护人和生物体正常生存必不可少的防 御系统,是生命不可缺少的一种特殊保护性机制(功能),具 有积极的生物学作用。 镇痛的目的意义 严重的疼痛能引起休克或引起人体各个系 统功能失调、免疫功能低下而诱发各种并 发症,甚者引发终身致痛性
7、残疾或危及病人 的生命。 及时施用镇痛法能有效地缓解、减轻、控 制和治疗疼痛, 预防剧烈疼痛诱发机体休克 等症状的发生所造成对机体的严重伤害, 有 效地保护机体、促使疾病的康复。 与疼痛相关的术语 1.感觉阈 受试者首次感觉到有刺感、温热感的最小 刺激量。 2.痛阈(pain threshold) 受试者首次能够识别引起 痛觉的最小刺激量。在人的心理物理或动物实验研 究中,为了检测痛阈或伤害性反应阈值,以能识别 50%的刺激为痛刺激的强度定为阈值或将能引起伤 害性反应的50%的刺激强度定为伤害性反应阈值。 3.痛耐受水平(pain tolerance level)是指受试者能 够忍受痛的最高水
8、平,与痛阈一样,也可用刺激强 度测量,但不代表刺激强度。 4.镇痛或无痛(analgesia) 是指在机体正常或病理 状况下,痛刺激不能够引起痛及痛反应。 5.麻醉性镇痛药 指药物通过阻断中枢神经系统 (CNS)痛觉冲动的突触传递镇痛的镇痛药。 6.解热镇痛药: 指药物通过阻断外周痛觉感受 器产生痛觉冲动而发挥镇痛作用的药物。 7.内脏痛 (visceral pain)是由内脏器官障碍所引 发的,它包括由于阻塞或肿瘤所致的扩张、缺血 、炎症及肠系膜的牵拉等,能引起联合症状,如 发热、恶心、不适和疼痛。内脏痛觉是因感觉 传入神经刺激内脏器官活动的结果。临床上极 为普遍的症状,常伴有情绪反应和防御
9、反应。 8烧灼痛(causalgia) 特指在外周神经创伤性 损伤后发生的一种持续的烧灼样自发痛、痛敏 和异常痛敏等症状,并伴有萎缩、血管运动和 汗腺分泌功能障碍等植物神经功能紊乱症状。 9.牵涉性痛(referred pain) 是内脏关联痛的 重要特征之一,以胸腹盆腔内脏器官病变为原 因而发生的内脏痛常常在远离痛因部位的某躯 体部位而被感知,这种非痛因部位的躯体痛被 称之为牵涉痛。牵涉痛只发生在接受传导内脏 痛冲动的传入纤维所进入的脊髓后根所支配的 躯体部位。 10.纤维肌痛(FM) 指非骨关节的广泛平滑肌痛,并有触 痛点。美国风湿学会拟订的诊断要点为:身体两侧广泛 痛(腰或腰以上的中轴线
10、骨骼肌痛)超过3个月,T 双侧触 痛 ,可能伴有头痛 、抑郁 、焦虑 、刺激性 排便 、自 主神经 功能 紊乱、神经内分泌改变等。 11.复合性局部疼痛症候群(CRPS 型),旧称反射性交感 神经营养不良 实为创伤后疼痛症候群,表现为持续痛, 有时有刺蜇痛, 亦有书将其分为:炎症性疼痛、神经性 疼痛、血源性疼痛、代谢性疼痛、免疫源性疼痛、心理 性疼痛。 其中炎症性疼痛是慢性痛中最常见的原因之一 ,可 表 现 为长期的酸痛,隐痛或定期及不定期的发作痛,有时 可有明确的定位疼痛 ,有时则缺乏。 12.炎症 炎症是“各种内源性、外源性刺激引起细胞损伤,同时引 起伴有血管反应的结缔组织的复合性反应”。
11、依据炎症持续时间 ,分为急性炎症和慢性炎症。前者通常病程为数天,以渗出液反 应(蛋白成分多的细胞外液浸润)和中性粒细胞反应主。后者 的细胞成分以淋巴细胞和巨噬细胞为主,伴有组织坏死或组织 修复环节之一的纤维化反应,病程趋亍复杂。其主要是以“病情 经过”来定义,疾病表现趋于多样化。 13.炎症疼痛: 组织炎症或造型引起的炎症模型均可引发痛阈敏 化, 产生疼痛, 引起炎性疼痛。与疼痛有着密切相关, 炎性疼痛, 是由于炎症引起组织肿胀、炎性渗出物压迫神经纤维末梢和强 致痛性的致炎性介质释放直接作用于神经末梢。如缓激肽、5- HT、前列腺素等能敏化伤害性感受器而诱发痛过敏(1), 大鼠后肢 足跖中部皮
12、下注射角叉菜胶造成炎症痛过敏(2), 链脲佐菌素诱发 大鼠糖尿病性神经痛模型, 其行为伤害性痛阈值明显降低, 表明 糖尿病大鼠处于痛过敏状态。 14.痛敏(或痛觉过敏) hyperalgesia(或 hyperesthesia) 是指在组织或神经损伤后,正 常情况下,一定阈上痛刺激强度在损伤部位或损 伤以外部位引起更强的疼痛。或对伤害性刺激 产生过强的疼痛反应。 痛敏分为原发性痛敏(primary hyperalgesia) 和继发性痛敏(secondary hyperalgesia) 痛敏只是感觉强度上的量变,但无感觉模式上 的质变。 痛敏可能是外周和中枢神经系统结构或功能改 变的结果。 1
13、5.痛觉超敏或称痛性感觉异常(allodynia) 是指在组织或神经损伤后,正常情况下不引起 痛的刺激,或指在非伤害性刺激作用下产生痛 觉。如触刺激、轻压刺激、非伤害性冷或热刺 激,能在损伤或损伤以外部位引起痛。 异常痛敏与痛敏不同,它在刺激-感觉模式上 发生了“质变”,已失去了感觉模式的特异性。 痛敏只是感觉强度上的量变,但无感觉模式上 的质变。 16.中枢性疼痛(central pain,CP)是指由于中 枢神经系统本身伤病所造成的自发痛和对 于外加刺激的过度疼痛反应,包括一种不愉 快的触物感痛(dysaesthesia)。 17.自发痛(spontancous pain) 指在没有可见
14、的刺激条件下产生的痛觉。 18.神经痛(neuralgia)是指疼痛沿着单根 或多根外周神经分布或放散。而神经痛的 使用较广泛。 19.神经痛 常由创伤或疾病所致的神经根、神经节 、祌经丛、祌经干或其分支的原发或继发性损害引 起的异常疼痛。多见于颈肩腰腿痛等病证。是一种 临床常见的慢性痛。或是指疼痛沿着单根或多根外 周神经分布或放散。神经痛的使用较广泛。 20.神经炎 (neuritis)是指外周单根或多根神经炎 症。只有在确定炎症时才使用神经炎。是指疼痛沿 着单根或多根外周神经分布或放散;只有在确定炎 症时才使用神经炎。而神经痛的使用较广泛。 21.神经源性痛(neurogenic pain
15、)是指由中枢或外 周神经原发性损伤、功能障碍或一过性激惹而引起 的疼痛。 22.伤害性痛(nociceptive pain) 是在机体组 织损伤或向机体施加具有造成组织损伤潜在性 的伤害性刺激时所发生的一种疼痛。有生理性 伤害性疼痛(physiological pain)、非生理性 或称病理性疼痛(pathological pain)。 分为躯体性疼痛(somatic pain)和内脏性疼 痛(visceral pain)。 躯体性疼痛有皮肤、黏膜部位的表浅痛( superficial pain)和骨骼肌、骨骼及关节等部 位的深部痛(deep pain)。 22.神经源性疼痛(neurogen
16、ic pain )是由于 中枢或外周神经原发性损伤、功能障碍或一过 性激惹而引起的疼痛(综合症),包括自发痛和诱 发痛。 23.神经病理性痛(neuropathic pain)又称神 经性疼痛 系指中枢或外周神经组织自身受损 伤或炎性病变引起的疼痛感觉系统功能异常所 引起的伴随性疼痛和神经系统激惹一过性异常 兴奋所产生的持续性的慢性疼痛,疼痛常在损 伤后一段时间发生,伴有感觉异常。或泛指由 神经系统原发性损伤或功能障碍所引起的疼痛 。 24.精神源性痛(pain of psychological origin) 是在机体无任何 病理性异常时所表现的一种疼痛。它包括由精神妄想( delusion
17、)或幻想(hallucination)、癔病(hysteria)、转换 (conversion,指由情绪转换为躯体症状的过程)、疑病症( hypochondriasis)或抑郁症(depression)等精神性疾患所引 起的疼痛。 25.周围神经病理性疼痛(多发性神经病痛) 因小神经纤维受累所 致,见于糖尿病、血管炎、AIDS、尿毒症、毒物和药物中毒, 以及淀粉样变性。 26.交感祌经依赖性疼痛(SMP)和交感祌经非依赖性疼痛(SIP) 前 者指如果交感神经阻断后疼痛减轻, 而后者指若始疼痛不减轻。 27.脊髓刺激(spinal cord stimulation, SCS) 指通过放置硬膜外隙
18、 电极,提供电刺激作用于脊髓后根。 镇痛药常用给药途径 应采用拟推荐临床应用的给药途径。 给药途径一般采用二种, 其中一种应与临床相 同。如确有困难可采用其他给药途径, 但应说 明困难的原和选用其他给药途径的理由。 溶解性好的药物, 可注射给药,但要排除非特异 性反应。 粗制剂或溶解性差的药物,可使用单一的给药途 径。 注射给药或离体实验时应考虑到样品中杂质、 不溶解始质、无机离子及PH浓度等因素对实 验的干扰。 镇痛的常用给药途径 动物实验常用 肌内给药、腹腔内注射、关节内注射、口 服给药、皮下给药、皮肤给药、粘膜给药 、脑室给药、脑内神经核团给药、脑脊腔 内给药、鞘内注射给药、蛛网膜下腔注
19、射 给药、经皮给药、经粘膜给药等以评价其 药效及其作用机制、毒性。 (一)小鼠侧脑室注射给药 小鼠。剪去小鼠头部毛, 消毒皮肤, 在头頂部注射部 位剪去直径约0.8 cm皮肤。将小鼠头腹位固定, 用微 量注射器, 于小鼠头部两耳连线与矢状缝交点的左右 前外各2 mm进针, 深度约2 min, 约10s内注射完, 停 针1 min 出针, 用胶尼封口。 一次注射量10l。给药10 min ip1%醋酸溶液, 观察 记录15 min小鼠扭体次数, 计算小鼠扭体抑制%, 求 出 icv ID50。 试验前进行预测, 注射1 %伊文氏蓝注入脑室注即刻 处死小鼠, 剖检观察伊文氏蓝是否进入脑室, 以确定
20、 注射部住, 以后按照此坐标定位给药。 (二)大鼠侧脑室注射给药 大鼠乙醚麻醉后, 固定于脑立体定位仪上。剪 去头部毛, 切开皮肤, 暴露颅骨。 剥离附着在颅骨的组织, 用脱脂酒精棉球擦干 颅骨, 在矢状缝外2mm, 冠状缝后2mm两平行 线交点, 用钻头打一个小孔, 用固定于立体定位 仪的微量注射器垂直植入孔内4mm, 每次注入 不超过20ul/只, 注射毕, 停针20秒出针, 用速凝 牙托粉封口, 15分进行测痛。 多次给药, 可植入导管, 用螺丝或速凝牙托粉浇 注固定, 术后45天进行实验。取合格大鼠, 随 机分组。 (三)家兔侧脑室注射给药 成年家兔, 雌雄不拘。剪去手术野毛, 碘酒
21、、酒精消毒, 于局部麻醉下, 在冠状缝离中线 4 mm处钻孔, 然后将一特制的家兔脑室套管 (塑料)插入脑室, 使套管的尖端位于侧脑室, 并固定于颅骨上。 (四)脑内神经核团给药 (五)鞘内注射给药 (六)蛛网膜下腔注射给药 (七)经皮给药 (八)经粘膜给药 一、小鼠扭体试验(writhing test) 【原理】把一定容量和浓度的化学刺激物质(醋酸 溶液等)或盐水注入小鼠腹腔内, 由于刺激脏层和 壁层腹膜,引起深的、大面积而持久的疼痛刺激, 引起深部广泛的腹膜炎造成腹壁肌肉紧张、炎性 疼痛, 致使小鼠出现典型的腹部肌肉收缩,同时伴 有一侧后肢外伸的躯体伸缩行为。 即腹部内凹、躯干与后肢伸张、
22、臂部高起,身体扭 曲等特征性的行为反应,称之为扭体反应(writhing response)(图20-2-1)。 潜伏期为35分钟, 以注射醋酸溶液后15分 钟内出现扭体反应频率为高。 醋酸诱发广泛的腹膜炎造成腹壁肌肉紧张 有躯体痛的参与而导致的。醋酸所引起的 伤害性反应, 可能由于腹腔PH值降低而直接 刺激伤害性传入神经纤维和促进炎症递质 合成引起的炎症和疼痛, 共同起作用。 随机分为对照组、广西血竭组、吗啡组。每组20 只。对照组、广西血竭组灌胃给药、每天一次, 连 读5天,于末次给药后60分,吗啡组一次腹腔注射30 分钟后,腹腔注射1醋酸溶液10mlkg后, 观察 记录注射醋酸溶液后20
23、 分内出现扭体反应鼠数和 扭体次数作为疼痛反应指标。并计算其均值、抑 制扭体反应次数百分率(抑制%) 对照组扭体次数均值药物组扭体次数均值 抑制% = - X100% 对照组扭体次数均值 广西血竭对小鼠醋酸扭体反应的影响 (xs, n = 20) 组别剂量(g/kg)扭体动物数(%)扭体次数 对照组20 (100%)42.60 11.4 广西血竭组 14.420 (100%)26.40 14.5* 吗啡组0.005 3 (15%) 0.20 0.02* 对照组 20 (100%)39.10 12.8 广西血竭组7.220 (100%)26.40 14.5* 吗啡组0.0053 (15%)0.2
24、0 0.02* 注意事项 1.扭体试验又称为扭动试验、腹部收缩试验。可应 用多种动物,以小鼠和大鼠最佳。 2.己证明多种物质腹腔注射可诱发小鼠扭体反应。 但应用最普遍的是醋酸溶液 3. Schmauss7提出了一个行为学评分标准,将扭 体行为分为03四个等级,根据这个评分标准可以 把行为学量化。因此,这种模型也成为评定其它 模型的一个对照标准。 4.腹腔注射生理盐水可诱发小鼠(4 %)、大鼠扭体 (6 %)反应, 应注意。 5.常用小鼠,亦用大鼠(费用高) 小鼠扭体反应诱发剂种类 诱发剂名称浓度(%)用量(ml/只) 醋酸溶液0.60.90.2 (小鼠) 0.52.5(大鼠) 酒石酸锑钾溶液0
25、.050.2 苯醌水溶液(饱和溶液)0.020.2 缓激肽溶液0.001250.2 2-苯-1,4-苯甲酰苯醌(含有5 %酒精水溶液)0.020.2 0.02%苯醌混悬于1%羧甲基纤维素溶液0.25 PgE131.6ug 乌头碱、乙酰胆碱、高岭土混悬液、酵母多糖溶液、五羟色胺、硫酸镁等。 5. 醋酸浓度为11时小鼠扭体最明显,注射后 35分钟小鼠出现明显的扭体反应。酸浓度为0 3,不出现扭体反应,醋酸浓度为 19时, 小鼠活动减少。室温在2022扭体反应最典型, l6时小鼠扭体反应不稳定,28时小鼠活动减 少8。 6.诱发剂浓度及用量应通过预试验确定。 7.酒石酸锑钾溶液务必于临用时新配, 放
26、久效用 减弱。 8.对照组小鼠扭体反应次数, 一般在控制在25 30次为宜。 【评价】 1.小鼠扭体法是筛选镇痛药的常用方法之一,尢其 是弱镇痛药的一种常规筛选试验方法。适合于中 枢和外周镇痛药的筛选研究, 尤其用于外周镇痛药 的评价。其试验的作用强度和临床镇痛效果具有 明显的相关性。 2.观察记录药物抑制小鼠扭体鼠数或扭体次数, 以 出现扭体鼠为阳性, 不出现扭体鼠为阴性, 计算其 ED50, 评价药效作用强度。所反应药效作用前者强, 后者弱。 3.己被许多学者所采用的一种操作简单、敏感、 方便、重复性好、经济实惠的实验方法。 4扭体反应代表内脏痛(紧张性病理性疼痛), 亦是 应用最为广泛的
27、内脏痛模型之一。无刺激特异性 。方法缺乏特异性, 一些非镇痛药,如中枢抑制剂、 阿托品、利多卡因等有抑制扭体反应,出现假阳性( 应结合其他测痛方法), 约有8的动物不出现扭体 反应,而且不能在同一个动物上观察药物的时效 作用。 家兔K 离子皮下透入致痛实验(K+ pain test) 【原理】正常情况下,细胞膜内外K+浓度相差极大 。局部组织受损时,组织释放的K+ 为一种致痛物质 。当K+浓达到1015mmol/L时即可致痛。 由于输入电流强度与K透入及其引起的疼痛反应呈 正比,给药后电流强度的变化直接反映受试药物镇 痛作用强弱。当在一定强度直流电场作用下,饱和 氯化钾溶液可以经不同部位皮肤透
28、入动物体内产生 伤害性刺激,引起动物疼痛反应,以家兔缩腿,摇 头,挣扎、扬爪等反应作为痛阈指标, 观察受试药物 对家兔痛阈的影响。当给药后,家兔上述反应消失或 减弱。表明受试药具有镇痛效应。 方法 选用体重1.52.0公斤家兔,雌雄不拘 家兔置于固定器中。除去左耳尖部位毛。将浸泡饱和氯 化钾溶液的棉球置于耳尖部,把K- 4型测痛仪的刺激 电极置于棉球上并固定好,保持湿润状态。无关电极为 针状电极,插入后腿,并用生理盐水湿润纱布盖上。以 引起家兔摇头或全身挣扎反应作为疼痛反应指标,记录 从通电开始至引起家兔痛反应的电流强度(mA数)作 为痛阈值。给药前测定痛阈二次,取其mA数均值作为 基础痛阈值
29、。给药后60分测痛,每10分钟测痛一次, 观察2小时, 计算给药后痛阈值提高百分率,与对照比较, 检验组间电流强度显著性差异。必要时可测定其ED50值 。 大鼠法: 测痛仪的输出电极(正极)于尾部下13处 用乳胶管固定,无关电极用盐水纱布固定于尾根部 ,以甩尾(嘶叫、全身挣扎等)反应作为疼痛反应 指标,记录甩尾的电流强度(mA)作为嘶叫和运动痛 阈,并计算出镇痛指数。 由于阈电流增加反映镇痛药效应强度和有效时程, 与对照组比较,阈电流增长2倍以上可认为药有镇 痛作用,或计算其ED50值。若痛阈测定用固定电流 强度, 记录动物痛反应时间作为痛阈值, 计算PMAP, 以给药后痛阈值超过基础痛阈一倍
30、为100%镇痛。 猴实验 以缩腿、挣扎为疼痛反应指标 价昂贵,不宜用于药物筛选 【评价】 本方法采用K+-4型测痛仪测痛, 输入电流强度与K 透入及其引起的痛反应呈正比,阈电流增减反映药 物镇痛作用强弱,并可以同时观察其作用时程。操 作方便,灵活、反应指标明确, 直观记录,能准确 测定痛阈值, 结果重现性好, 为常用测痛方法之一 。广泛用于研究镇痛药的效价强度和作用时程。 为了进一步了解药物作用方式并找到更适于人的 治疗量,在一种新化合物试用于临床前还需要用猴 进行实验。 【注意事项】 1. 实验必须在12hL/12hD光周期的恒温(22 26oC)、恒湿、安静的光控实验室进行, 实验前7天
31、将动物置于光控室饲养。 2. 每次实验必须在同一时间进行。 3. 安放电极耳尖部位必须脱毛,电极必须固定牢, 并经常用生理盐水保持湿润状态。 4. 输入电压必须稳定。 5. 为了避免损伤,规定最强的电流为10mA为限 。 小鼠光辐射热甩尾法 (tail-flick test) 【原理】小鼠光辐射热甩尾法也叫光热甩尾或光 照甩尾。是将一束光照射到动物尾根1/3处,使鼠 尾局部升温,产生热刺激,当其尾部受到伤害性刺激 超过动物忍耐的痛阈时,动物出现明显甩尾的躲避 反应, 是一种脊髓的屈曲反射。 光辐射热甩尾是急性伤害性知觉疼痛的测痛方法, 反应体表痛, 疼痛持续的时间长短不。 以动物甩尾作为痛反应
32、指标,记录动物自光照射开 始到甩尾反应的时间(潜伏期)作为疼痛阈值。根 据动物痛阈值高低变化来判断药物的镇痛效应。 方法 小鼠,雌雄兼用, 体重18-22g。实验前12小时禁食, 不禁水。 把小鼠装入小鼠固定筒内。尾部暴露于外,实验 前先用75%乙醇檫净鼠尾,用黑墨汁涂于尾根部 下1/3处作为光刺激点的标记。测痛时,使小鼠尾 光刺激点与YLS-12A鼠尾光照测痛仪聚光灯灯孔 重合,待动物安静后进行测痛,以鼠尾受热刺激出 现甩尾作为疼痛反应指标。记录小鼠从开始光照 射到甩尾反应的潜伏期(TFL, s)作为痛阈值。预 选基础痛阈57秒小鼠供实验用。 取合格小鼠随机分为对照组、OT-05B组(26g
33、 、18g/kg)、吗啡组(阳性药组,5 mg/kg)。每 组10只。各组给药前连续测痛2次,取其均值 作为给药前基础痛阈值。 各组肌肉注射给药后45分测痛, 计算其均值及 痛阈提高百分率, 痛阈提高率%。 给药后TFL一基础TFL 痛阈提高率% = - X 100 % 基础TFL ,与对照组比较, 检验其组间显著性差异。 .对小鼠辐射热甩尾痛阈值的影响 组 别剂 量 (X/kg) 动物 数 药前痛阈 值(s) 药后痛阈值 (s) 痛阈提高 % 对照116.80.87.10.6 OT- 05B 18g127.30.97.91.48.2 吗啡5mg137.10.613.91.5*95.8 对照1
34、47.00.67.20.8 Te-05B 26g136.61.08.31.0*22.7 【评价】 1. 热刺激引起的疼痛与生长抑素有关。光辐射热 甩尾法试验, 是防御性的反射,主要在脊髓水平进 行整合。是一种脊髓的屈曲反射, 反应体表痛。可 以测定轻度麻醉的动物而不受动物运动协调性的 影响。在实验观察中,动物的跑反应是大脑控制的 复杂现象。甩尾法比热板法具有优越性。但必须 引起注意,本法纯粹是一种脊髓反射,骨骼肌松弛药 可能呈阳性结果。 2.适用于筛选麻醉性镇痛药,但对弱镇痛药,如阿斯 匹林则出现阴性结果。 3. 光辐射热甩尾法试验,终点指标直观、明确,记录潜 伏期准确。设备简单、操作方便,故
35、常用。 4.甩尾反射法只能检测简单伤害性反射,而不能对动 物意识性或目的性的反应进行客观检测。甩尾实验最 终的行为反应也较为复杂(如舔其后爪)。 5.使用动物有小鼠、大鼠、,免或豚鼠。常用小鼠或大 鼠, 以甩尾潜伏期为痛反应指标。小鼠易得, 经济、便 于操作。大鼠每组不少于5只。免照射鼻部或嘴角, 以 引起甩头潜伏期为痛反应指标,每次照射不超过30秒 。当给药后痛阈值提高大于基础痛阈值的200%,停止 照射,以200%作为最大值。 豚鼠照射背部皮肤,以皮肤或肌肉抽搐颤动为痛反指 标。 【注意事项】 1.试验必须在标准等级实验动物室进行,确保实验 环境条件的恒定性。确保实验结果的的可靠性、 重现
36、性。 2.实验程序化,分组应注意体重、组间痛阈值的均 匀性、试验时间的一致性(避免时辰差异对实验结 果的影响)。 3.控制刺激强度(光辐射热),刺激强度应经过预测, 强度适当,用药前的基础痛阈值非常重要, 刺激时间 不宜大长,测定次数不宜大多, 避免烫伤尾巴,影响 实验结果。 4.为了确保光照射点的一致性, 应用黑墨汁涂于尾 端1/3处作为光刺激点的标记。同时增加吸热度。 测痛时,必须使小鼠光刺激点与光热测痛仪聚光 灯灯孔重合,并待动物安静后进行。 5.鼠尾表面积大,易散热,尾温度可能会影响实验结 果, 室温对甩尾潜伏期有明显的影响,容易造成假阳 性或假阴性,室温一般为2022oC。 冷板诱发
37、的痛觉超敏 【原理】利用4金属冷板作为刺激,诱发病理性 痛模型动物出现以抬爪为主要表现的痛觉超敏( allodynia)现象,给药后抬爪次数的变化可直接 反映受试药物镇痛作用的强弱。 . L5/L6脊神经结扎模型小鼠的建立:选用8周龄 雄性C57BL/6小鼠,在乌来糖(1200mg/kg, 腹腔 注射)的麻醉下手术分离并结扎小鼠右侧L5和L6 脊神经制备坐骨神经病理性痛模型小鼠。 恢复两周后进行模型筛选,凡是4金属冷板刺激 引起的小鼠5分钟抬足次数大于10次可视为动物模 型合格,可用于进一步的实验 实验分组:将制备好的坐骨神经痛模型小 鼠随机分为盐水对照组,1.0106 U/kg干扰 素-注射
38、组,2.5106 U/kg干扰素-注射组 和5.0106 U/kg干扰素-注射组。 模型小鼠疼痛行为学测定:将小鼠放在表面温度 为41的金属冷板上,并罩在一个有机玻璃方盒 或玻璃烧杯下,稳定5分钟,待小鼠探究活动基本 消失后,利用手控计数器单盲法记录小鼠损伤侧 脚掌5分钟内的抬足次数作为基础痛阈,动物因活 动或体位变化所引起的抬足不计入内。然后将生 理盐水或干扰素-一次腹腔注射给药后15分钟开 始测痛,每隔15分钟测痛一次,观察90分钟。 【评价】 本方法将实验动物放在可以自由活动的环境下进 行研究,最大限度地减少了人为因素给动物造成 的压力,且操作简便,反应指标明确,可以准确 地反映动物的痛
39、觉行为。为常用测痛方法之一, 广泛用于研究痛觉行为异常、针刺镇痛以及药物 对炎性痛和神经病理性痛的镇痛作用。 该方法也可通过测量动物脚掌在空中的停留时间 作为痛觉超敏指标,空中停留时间越短说明动物 痛阈越高,空中停留时间越长说明动物痛阈越低 。比较给药前后动物脚掌在空中停留时间的变化 可判定药物的镇痛作用。 此外,也可利用0-4冷水代替冷板进行测定。 在直径20 cm的玻璃容器中放入,深度约2 cm左右 的0-4冷水,将大鼠放入容器中,5分钟后记录 大鼠在冷水中的抬足次数,记录时间为5分钟。 【注意事项】 实验必须在恒温(2226)、恒湿、安静的隔 音实验室进行。 每次实验在8:00-18:0
40、0进行,且最好保持在每 天的同一时间段进行。 实验前3天开始对测试动物进行冷板刺激,每天 1次,每次10分钟,使动物适应测试平台并诱发稳 定的痛觉超敏。 由于4是一种非伤害性刺激,很少引起正常 大鼠的抬足反应,因此该方法一般不以正常动物 作为研究镇痛药物的受试动物。 此外,一些神经病理性痛动物模型,如坐骨神经 部分结扎模型等,往往不表现冷诱发的痛觉超敏 现象,所以在利用这些模型研究镇痛药物的作用 时也不宜采用此方法。 丙酮诱发的痛觉超敏 【原理】利用丙酮挥发过程吸收热量引起的冷刺 激,诱发动物出现以缩足反应为主要表现的疼痛 反应,给药后缩足反应次数或潜伏期的变化可直 接反映受试药物镇痛作用强弱
41、。 方法 1L5/L6脊神经结扎模型大鼠的建立:依据Kim 和Chung报道的方法。 2实验分组:将制备好的L5/L6脊神经结扎痛模 型大鼠随机分为盐水对照组,2.5 mg/kg吗啡注射 组,5.0 mg/kg吗啡注射组和10 mg/kg吗啡注射组 。 3模型大鼠疼痛行为学测定:将模型大鼠放在金 属网架上,并罩在一个有机玻璃方盒内,适应20 分钟后,利用连接有聚乙烯细管的注射器向模型 大鼠脚跟滴一滴丙酮溶液(约20微升),观察模 型大鼠是否出现缩足反应。连续测量五次(时间 间隔为2分钟),如果模型大鼠出现缩足反应的次 数超过三次,则认为该动物出现了明显的冷诱发 的痛觉超敏,以缩足反应的次数作为
42、基础阈值。 然后将吗啡一次皮下注射给药后30分钟开始测痛 ,每30分钟测痛一次,观察4小时。 【评价】 本方法采用丙酮诱发的缩足反应测痛,反应指标 明确,可直观记录,为常用测痛方法之一,广泛 用于研究各种镇痛药物的效价强度和作用时程, 以及药物对炎性痛、癌性痛和神经病理性痛的镇 痛作用研究。 由于该方法每个时间点一般需多次重复测量,操 作起来相对较复杂。 此外,该方法也可通过记录动物出现缩足反应的 潜伏期作为痛觉超敏指标,测定5次取其平均值。 【注意事项】 实验应在室温(201)、恒湿、安静的隔音实 验室进行。 每次实验在8:00-18:00进行,且最好保持在每 天的同一时间段进行。 向动物脚
43、掌滴加丙酮时注意不能触到动物脚掌 ,以免人为引起缩足反应。 如果同时进行双侧脚掌的痛阈测定,应首先测 定损伤对侧脚掌。 冷诱发的甩尾反射 【原理】利用冷水浸尾诱发动物出现以甩尾反射 为主要表现的疼痛反应,给药后痛阈的变化可直 接反映受试药物镇痛作用强弱。 模型大鼠疼痛行为学测定 首先将各组模型大鼠尾巴浸入0冰水中( 5 cm),记录大鼠出现甩尾反射的潜伏期 ,重复测定3次(时间间隔为15秒钟),取 其平均值作为基础痛阈。 将药物一次鞘内注射给药后55分钟测定其 甩尾反射的潜伏期。 【评价】 本方法采用0冰水诱发的甩尾反射进行测痛,操 作简便,无须特殊设备,反应指标明确,结果重 现性好,为常用测
44、痛方法之一,广泛用于针刺镇 痛以及阿片类镇痛药物的效价强度和作用时程研 究。 【注意事项】 实验必须在恒温(2226)、恒湿、安静的隔 音实验室进行。 每次实验在8:00-18:00进行,且最好保持在每 天的同一时间段进行。 实验前3天开始对测试动物进行冷水浸尾刺激 ,每天1次,使动物适应测试环境。 动物固定最好采用特制动物固定器,这样可以 保证每次测试过程动物的固定强度一致,减少因 手抓力量不同所导致的结果差异。 每次实验最少重复三次,取其平均值。 电刺激小鼠甩尾法 【原理】 应用恒定的电压或电流参数经皮肤或电 极刺激鼠尾出现疼痛反应, 是由于兴奋C纤维产生 传入放电引起的疼痛反应。 以小鼠
45、受刺激后出现甩尾、嘶叫作为痛反应指标, 记录其电压或电流参数作为疼痛阈值,根据给药前 后痛阈的变化评价药物效应。 分别将小鼠放入小鼠固定器中,每次刺激前均用 75酒精擦洗鼠尾后,再用生理盐水棉球涂擦小 鼠尾根刺激区以增加皮肤导电性。实验时将刺激 电极(BL一410生物机能实验系统)放置于小鼠的尾 根部,进行刺激:以程控方式输出电刺激,刺激 电压根据预实验从20 V起,间隔2 s以步幅 1 v递增 刺激电压强度,至小鼠开始出现挣扎、甩尾或抖 尾、撕叫等痛反应,此时的电压值为该鼠的痛阈 值。 先记录给药前小鼠出现痛反应的电压作为基础痛 阈,随后各组小鼠分别灌胃给药1小时h后,将小 鼠放入小鼠同定器
46、中,按同法记录小鼠出现痛反 应的刺激阈值电压,电刺激电压为35V为限,电压 超过35V者均记为35V。按下式计算痛阈提高百分 率。 药后痛阈均值 - 药前痛阈均值 痛阈提高百分率(%) =- 100 % 药前痛阈均值 芎附正天软胶囊对电刺激小鼠痛反应的电压阈值的影响 (xs ,n = 10) 组别剂量(g/kg给药前电压 (V) 给药后电压(V)痛阈提高率 (%) 溶媒对照组PEG-400 24.71.9526.02.875.3 阿斯林肠溶片0.1523.21.8727.22.3917.2 芎附正天软胶囊1.025.51.6529.13.41*14.1 芎附正天软胶囊0.525.82.6629
47、.53.63*14.3 芎附正天软胶囊0.25 24.91.6027.42.4110.0 L1 【评价】 电刺激鼠尾-嘶叫法是对组织施加短暂的可逃避的 伤害性刺激,造成一种时相性急性疼痛,称为急 性实验痛。反映体表痛。疼痛持续的时间也长短 不一。一般认为动物嘶叫的整合中枢涉及高位脑 干(如中脑),能反应强、弱、镇痛药物的效应,但 机体组织阻抗不易控制,敏感性不高,反应与动物的 种族、品系、年龄、性别及基础阈值等因素有关 。由于本法有反射性因素,临床无镇痛作用的药物 可能呈阳性反应。 不如机械刺激实验方法严谨。设备简单, 痛反应指 标明确,直观记录, 方法可靠、重现性好。 【注意事项】 1.电刺激鼠尾致痛法个体差异较大,应预选合格小 鼠供实验。于鼠尾刺激部位涂上薄层导电胶,以增 加导电性能。 2.电(方波)刺激是生理药理最常用的实验方法之 一,而刺激仪功能的强弱、方波设定范围的宽窄、 波形的好坏、使用方便与否往往是实验成败的关 键。 3.刺激参数文献报道不一。,必须经预试验确定最 佳刺激参数。 角叉菜胶诱发大鼠炎痛模型 【原理】外周伤害性信息传人可导致痛及痛过敏。 大鼠右后掌足跖部皮下注射后角叉菜胶后,动物出 现早期的痛反应和随后的痛觉过敏,表现为局部迅 速肿胀,动物出现反复抬腿,舔足、摇动后掌,后 掌抬离盒底等自发痛行为。随着炎症介质的释放, 加强炎症,也增加对疼痛的
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