南京农业大学生物化学课件14.ppt
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1、第五节 酶的提取纯化与活力测定 一.酶的分离与提取 酶提取基本的方法 细胞产生的酶有二类: 1. 由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶,称为细胞 外酶。这类酶大部分属于水解酶。此类酶通常含量高,容 易得到。 2. 在细胞内合成后并不分泌到细胞外,而在细胞内起催 化作用,称为细胞内酶,该类酶在细胞内往往与细胞器结 合,不仅有一定的区域性,而且催化的反应具有一定顺序 性。 A. 了解所分离酶在细胞中分布 B. 材料的获取 在提取某一酶时,首先应当根据需要,选择含 此酶最丰富的材料。由于从动物内脏或植物果实中 提取酶制剂受到原料限制,成本又很大,因此,目 前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的
2、 酶制剂。 一.酶的分离与提取 酶提取基本的方法 C. 酶分离纯化的主要步骤 1.主要步骤为:抽提、纯化、结晶 抽提:破碎细胞,动植物组织一般可用组织捣碎器 ;或者加石英砂研磨,将材料做成丙酮粉或进行冰 冻融解 ;对细菌,常采用加砂或加氧化铝研磨和超 声波振荡方法破碎。 大多数酶一般都用缓冲液进行抽提,缓冲液的 类型决定于酶的种类和理化特性,抽提液pH最好远 离等电点 。 一.酶的分离与提取 酶提取基本的方法 C. 酶分离纯化的主要步骤 1.主要步骤:抽提、纯化、结晶 浓缩:抽提液或发酵液中酶浓度往往很低,必须浓 缩富集。常用的浓缩方法有:加中性盐或冷乙醇沉 淀后再溶解,胶过滤浓缩以及超过滤浓
3、缩法等。 纯化:纯化过程就是去除杂质的过程。原则:一方 面是要提高酶的纯度,另一方面却也使酶的总量不 可避免有所损失。 一.酶的分离与提取 酶提取基本的方法 C. 酶分离纯化的主要步骤 1. 主要步骤为:抽提、纯化、结晶 结晶:浓缩液经过各种方法的纯化,可得到较纯的 结晶产品。 一.酶的分离与提取 酶提取基本的方法 C. 酶分离纯化的主要步骤 2. 选择分离纯化方法 a.盐析法(如硫酸胺) b.有机溶剂沉淀法 c.层析纯化法(葡聚糖凝胶、阴离子交换层析) d.等电点法 e.吸附分离法 一.酶的分离与提取 酶提取基本的方法 1. 酶活力概念 酶活力 是酶促反应的能力。酶活力大小 就是指在一定条件
4、所催化的某一化学反应速 度的快慢,即酶催化的反应速度越快,酶活 力越高,反之则表示该酶活力低。 二.酶活力及其测定 但是,酶的定量并非对其蛋白质进行 定量,而是对它的催化能力进行定量 。 所以,酶的定量就是测定酶的活力,所以,酶的定量就是测定酶的活力, 也即测定酶促反应的速度。也即测定酶促反应的速度。 二.酶活力及其测定 1. 酶活力概念 如何测定酶活力?如何测定酶活力? 以以产物浓度产物浓度对对反应时间反应时间作图,可得到作图,可得到酶促反应酶促反应 速度曲线速度曲线 0 0 产物浓度产物浓度 时间时间 注意:初速度的注意:初速度的 测定是关键,为测定是关键,为 什么?什么? 二.酶活力及其
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