项目一 动物组织中核酸的提取与鉴定.ppt
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1、动物组织中 核酸的提取与鉴定 项 目 一 一、实验目的 学习和掌握用盐溶法盐溶法从动物组织 提取核酸的原理和操作技术。 了解定性鉴定核酸的原理和方法 。 二、实验原理 根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白 在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解 度不同进行分离,然后用蛋白质变 性沉淀剂去除蛋白,使核酸释放出 来,再利用核酸不溶于乙醇的性质 将核酸析出,达到分离提纯的目的 。 三、实验材料 试剂 地衣酚(orcinol)试剂: 称取100mg地衣酚溶于100ml 浓盐酸中, 再加入100mgFeCl36H2O,该溶液应在 使用前新鲜配制。 二苯胺试剂: 称取1g二苯胺(经重结晶)溶入100ml冰 醋酸中,再加
2、入2.75ml浓H2SO4摇匀,冰 箱内保存备用。 三、实验材料 试剂 0.14mol/L氯化钠溶液 (内含0.01mol/L柠檬酸),250ml; 1mol/L氯化钠溶液,250ml; 95%乙醇(冷); 氯仿; 异戊醇。 三、实验材料 实验器材 冷冻离心机(3000rpm); 组织捣碎机或组织匀浆器; 不锈钢剪刀; 冰浴; 试管、试管夹; 量筒、吸管; 带塞比色管、带塞离心管。 玻棒、烧杯; 电炉等。 四、实验方法 1. 制匀浆 将新鲜肝脏或冷冻肝脏称重后用冷的 0.14mol/L氯化钠溶液(内含0.01mol/L柠 檬酸)洗去血水,用不锈钢剪刀将肝脏剪成 碎块,放入组织捣碎机中加入2倍体
3、积的 0.14mol/LNaCl溶液(内含0.01mol/L柠檬 酸)制备匀浆。 将匀浆置离心机中离心20min(3000rpm) 。上层液倾出留待抽提RNA ,下层用二倍体 积冷的1mol/LNaCl溶液抽提1h,待分离 DNA核蛋白。 四、实验方法 2. 核酸的抽提 RNA的提取 0.14mol/L的NaCl抽提液(内含RNA核蛋白 )加入等体积的氯仿和1/40体积的异戊醇, 置带塞离心管中,振摇30min,此时提取液为 乳白色混悬液,以3000rpm离心15min,离 心物呈三层。 用滴管吸出上层清液,在低温下加入1.52倍 的冷95%乙醇,并轻轻搅拌。低温放置15min ,3000rp
4、m离心10min,弃去上清液,即得 RNA颗粒状沉淀,待定性。 四、实验方法 2. 核酸的抽提 DNA的抽提 将抽提1h的1mol/LNaCl匀浆悬液以 3000rpm离心20min,弃去沉淀,将其上 清液倒入带塞的离心管中,加入等体积的 氯仿及1/40体积的异戊醇振摇30min,离 心20min。将其上清液加入2倍体积的冷 95%乙醇,边加边摇,抽出玻棒,纤维状 DNA就缠绕在玻棒上待定性。 每次都需采用冷冻离心。 四、实验方法 3. 定性试验 RNA的呈色反应 取2支干净试管,一管加入1.5ml RNA溶液, 另一管加入蒸馏水1.5ml,向两管中加入3ml地 衣酚试剂,于沸水中加热10mi
5、n,由黄色变为 绿色为阳性反应。 DNA的呈色反应 取2支干净试管,一管加入1.5mlDNA溶液, 另一管加入蒸馏水1.5ml,向两管中加入3ml二 苯胺试剂,于沸水中加热10min,由乳白色变 为蓝色为阳性反应。 五、注意事项 在提取分离纯化核酸时,为了保持核酸 的完整性,防止核酸变性降解,操作时 必须防止过酸或过碱。全部过程应在低 温下(0左右)进行,必要时还需加入 抑制剂,以抑制核酸酶的作用。 加氯仿、异戊醇后振摇要充分,但又不 能太剧烈,以防DNA断裂。 要学会正确使用离心机,离心后,注意 上清液和沉淀的取舍。 六、项目总结及练习 1. 从动物组织(猪肝)中提取核酸 ,第一步是破碎肝脏
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