第三章细胞生物学研究方法.ppt
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1、第三章 细胞生物学研究方法, 细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术,第一节 细胞形态结构的观察方法, 光学显微镜技术(light microscopy) 电子显微镜技术 (Electron microscopy) 扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope ),一、光学显微镜技术, 普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术(FM) 激光共焦扫描显微镜技术(LCM) 相差显微镜(phase-contrast microscope) 微分干涉显微镜(DIM) 暗视野和倒置显微镜,分辨率:指区分开两个质点间的最小距离。光学显微镜
2、的 最小分辨率为0.2um,电子显微镜的最小分辨率为0.2nm。,(一) 普通复式光学显微镜技术,组成:光学放大系统:目镜和物镜 照明系统:光源、折光镜、聚光镜和滤光片 机械和支架系统,性能参数:分辨率(区分开两支点间的最小距离),(二)荧光显微镜技术 (Fluorescence Microscopy),原理与应用 荧光素直接标记技术 免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子 的定性定位研究: 如绿色荧光蛋白(GFP)的应用,(三) 激光共焦点扫描电镜技术 (laser scanning confocal microscopy),共焦点:是指物镜和聚光镜聚焦在同一个点上。,应用:
3、排除焦平面以外光的干扰,增强图像反差和提高分辨率(1.41.7),可重构样品的三维结构。,(四)相差和微分干涉显微镜技术,原理:光线通过不同密度的物质,滞留程度不同, 密度大,滞留的时间长,否则时间短,从而产生 光程差(相位差),显微镜可以把这种光程差转换为 振幅差。,反差的产生:以样品种不同部位的密度差别为基础, 产生通过光程差,通过物镜后面的差相板来夸大相 位差,从而造成人眼可见的明暗区别。,1. 相差显微镜(phasecontrast microscope),特点和应用:不需要染色,可观察活细胞、细胞 核、线粒体等细胞器的动态。在医学和生物学方 面应用广泛,如血液的观察,脓汁、分泌物的观
4、 察,细胞癌变得早期诊断,细胞的运动、细胞分 裂现象的观察等。,2. 微分干涉显微镜 (differentialinterference microscope),采用的是平面偏振光,通过棱镜折射分成两束, 分不同的时间经过样品的相邻部位,再通过棱镜的 汇合,夸大厚度的差别,从而造成明暗区别。,应用:观察活细胞中较大的细胞器。,A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epithelium seen with different types of LM. a) under bright-field b) phase-
5、contrast c) DIM,倒置显微镜:由于物镜、聚光镜和光源的位置颠倒过来而得名。它的物镜和聚光镜之间的工作距离很长,能直接对培养皿中的培养细胞进行观察。还可与电视录像、相差物镜、电影摄影等装置相连。,二、电子显微镜技术(EM), 透射式电子显微镜(TEM) 扫描式电子显微镜(SEM) 隧道式扫描电子显微镜(STM) 透射扫描电子显微镜(TSEM) 超高压透射扫描电子显微镜,电子显微镜与光学显微镜光路图的比较,电子显微镜与光学显微镜的比较,基本构造:(1)电子束照明系统:电子枪和聚光镜 (2)成像系统:物镜、中间镜和投影镜 (3)真空系统 (4)记录系统:荧光屏和感光胶片,电镜制样技术,
6、 超薄切片技术 负染色技术 冷冻断裂和冷冻蚀刻技术 三维重构技术 喷镀技术,1. 超薄切片技术,电子显微镜技术对样品的要求:(1)样品薄,一般是数十纳米 (2)保持样品的精细结构,超薄切片技术样品的厚度为4050nm,切片,染色(醋酸铀、硝酸铀和铅),超薄切片技术的步骤路线,(1)戊二醛 1963年开始用作超薄切片的固定剂。 作用原理:醛基和蛋白质、磷脂中的氨基结合,把相邻的蛋白 质交联起来,形成不可溶的网络。对于蛋白质、多糖和核酸的 固定效果好,对脂类的差。 优点:分子量小,比较容易进入细胞,固定的标本可大些(小 于12mm)。,(2)甲醛 是一种易挥发的还原剂,常用于光学显微镜的固定剂,在
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