葡萄WRKY3参与对植株生长调控及对ABA的应答8976506.doc
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1、毕 业 论 文(设计) 题 目: 葡萄WRKY13参与对植株生长调控 及对ABA的应答 目 录中文摘要.1Abstract.2引言.41 材料与方法.61.1 实验材料.61.1.1菌株及载体.61.1.2 常用酶、化学药品、试剂盒.61.1.3 实验仪器.61.2 实验方法.61.2.1 材料培养.61.2.2 材料处理.61.2.3 培养基的配置.71.2.4 重组质粒的鉴定.71.2.5 根癌农杆菌(GV3101)感受态细胞的制备及转化.71.2.6 花芽浸蘸法转化拟南芥及阳性植株的筛选.81.2.7 气孔开度测定.81.2.8 实时定量PCR.82 结果与分析.92.1 葡萄WKRY1
2、3的异源表达植株的获得.92.1.1 p-Super1300-WRKY13重组质粒的构建.92.1.1.1 p-Super1300-WRKY13重组质粒的菌落PCR鉴定.92.1.1.2 p-Super1300-WRKY13重组质粒的酶切鉴定.102.1.2 p-Super1300-WKRY13重组质粒转入农杆菌菌落PCR鉴定.102.1.3 转基因植株的筛选.112.1.4 转基因植株的PCR鉴定.112.1.5 转基因植株的WRKY13基因相对表达量.112.2 葡萄WRKY13异源表达植株生长的变化.122.2.1 葡萄WRKY13异源表达植株的种子萌发率.122.2.2 葡萄WRKY1
3、3异源表达植株根系的生长.132.2.3 葡萄WRKY13异源表达植株主根的长度.132.2.4 葡萄WRKY13异源表达植株侧根的数目.142.2.5 葡萄WRKY13异源表达植株侧根的长度.142.3 葡萄WRKY13异源表达植株对ABA的应答反应.142.3.1 ABA对WRKY13异源表达种子萌发率影响.152.3.2 ABA对WRKY13异源表达植株根系生长影响.152.3.3 ABA对WRKY13异源表达植株气孔开度的影响.162.3.4 葡萄WRKY13异源表达植株ABA相关基因的表达量.163 讨论.17致谢.19参考文献.20葡萄WRKY13参与对植株生长调控及对ABA的应答
4、摘要:葡萄作为一种具有高营养价值和经济价值的果树,对探明其生长发育的机制,提高产量和品质具有极为重要的现实意义。研究表明,转录因子和脱落酸(abscisic acid,ABA) 都能参与调控拟南芥植株生长发育,并且二者存在着联系,但尚未见葡萄转录因子WRKY13与ABA在调控植物生长发育作用的报道。本实验综合应用植物生理学和分子生物学等现代生物学技术,获得WRKY13异源表达植株,探究了葡萄WRKY13对植物生长发育的影响以及对ABA的应答反应。结果表明:葡萄WKRY13异源表达植株的种子萌发延迟,侧根数目增多并且种子萌发、根系和气孔表现出对ABA的不敏感性,ABA能够显著提高WKRY13异源
5、表达植株的ABA合成基因(ABA1、ABA2)和其信号途径的相关基因(ABI1、ABI3)的表达量,但差异不显著。关键词:葡萄;WRKY13;脱落酸;生长发育 VvWRKY13 regulates plant growth and responds to ABAStudent majoring in biological sciences Sun changming Tutor Prof. Liu XinAbstract: As a kind of high nutritional and economic value of fruit trees, grapes has very impor
6、tant practical significance to prove its growth mechanism and to improve the yield and quality. Previous study has shown that WRKY transcription factors and the plant hormone abscisic acid (ABA) in Arabidopsis thaliana could be involved in regulation of plants growth and development. In addition, th
7、e WRKY transcription factors could belocated in the process of ABA signaling pathways. But we yet cant see any reports about WRKY13 and ABA in grapes influencing plant growth and development. The study which applied plant physiology, molecular biology and other modern biology technology got VvWRKY13
8、 ectopic expression of plants, explored VvWRKY13 how to impact on plants growth and development and responded to the ABA. In the study, VvWKRY13 ectopic expression of plant showed a delay in seed germination and a increase in lateral root number. Besides we find that seeds germination, root and stom
9、a showed no sensitivity to ABA. The expression of volume of ABAs synthetic genes (ABA1, ABA2) and signaling pathways related gene (ABI1, ABI3) were influenced by ABA to rise to different extent, but the difference was not significant. It can be showed that WRKY13 can participate in the regulation of
10、 plants growth and development as well as the ABA signal transduction.Key words: Vitis vinifera;WRKY13;Abscisic acid; Growth21 缩略词对照表缩写英文名称中文名称ABAabscisic acid 脱落酸Ampampicillin氨苄青霉素ODoptical density光密度LBluria-bertani mediumLB培养基PCR polymerase chain reaction聚合酶链式反应X-gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-ga
11、lactoside5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷引言 葡萄是葡萄科(Vitaceae L.)葡萄属(Vitis L.)的藤本落叶果树,出现在白垩纪初期,是世界上最早驯化的水果之一,在古代,葡萄就已经被大量的栽培和用于酿酒1。据统计,现在世界葡萄栽培面积和产量居世界水果的第二位,并且我国葡萄产量居世界第五名。葡萄作为一种具有高营养价值和经济价值的果树,其生长发育过程中受到诸多不利的外界环境的影响。如夏季葡萄极易感染病害、秋季果实难以完全成熟和冬季花芽不能充分分化等等,导使我国的葡萄产量和质量无法达到较高层次,造成巨大的经济损失。葡萄生长发育的调控及其机制的研究受到科学工作者的关注,在生产过
12、程中,主要是通过对肥料和水利的控制,以及外施不同生长相关激素,从而达到对葡萄生长发育的调控。在研究方面,主要集中在葡萄花的形成、芽的分化以及果实成熟过程中相关基因表达量和生理指标的变化等方面。但是鲜见转录因子在葡萄激素调控植株生长过程中作用分子机制的研究报道。大量的研究发现证实在与种子萌发、叶片和根系生长、开花等发育相关的基因中存在WRKY结构域。最早发现的野生燕麦中的WRKY家族成员ABF1和ABF2参与了种子的萌发3;茄科中的转录因子ScWRKY1被证明在植物胚形成过程中发挥重要作用4;随后2005年Luo等发现拟南芥中WRKY转录因子参与了种子大小的形成5,特别是对拟南芥中WRKY2的功
13、能进行研究后,发现其可以调控种子萌发过程,其对脱落酸(abscisic acid,ABA)的敏感性增强,WRKY2可以调节由ABA诱导的幼苗生长停滞6;在最近的报道中,2013年Kang等发现拟南芥转录因子WRKY家族成员MINISEED可以调控SYG1类蛋白SHB1的活性,从而参与到种子发育过程7。而WRKY在植物花发育方面的研究也有相关的报道,在2011年Wang等发现转录因子WRKY参与了拟南芥的花粉形成8;而野生大豆的GsWRKY20异源过表达后,可通过影响花相关基因的表达量,从而影响了植物的开花时间9。但罕见在葡萄生长发育过程中WRKY转录因子的相关报道,Terrier等2005年进
14、行了葡萄浆果生长过程基因表达的研究,初步推测转录因子WRKY家族在这其中发挥重要作用10。 有报道称WRKY转录因子可以参与植株内激素等物质的生物合成,从而影响了植物的生长发育。在最新的研究中发现,转录因子WRKY是ABA信号途径的关键组分,特别是有关于某些WRKY是ABA诱导的对种子发芽起到负作用证明,但是转录因子WRKY在ABA信号途径其他方面的作用以及作用机制一直不是很清楚。ABA是一种重要的植物激素,在植物生长过程中发挥着重要作用,参与调控种子萌发,芽休眠,气孔运动,促进叶、花和果实脱落,引起块茎休眠、叶片衰老,促进果实产生乙烯和果实成熟等植物生长发育过程,同时参与植物体对干旱、盐胁迫
15、和极端温度等胁迫响应11。ABA调控生长发育方面发挥重要作用,前期在进行水稻愈伤组织、不定胚发育及其植株再生的研究时发现,ABA可以促进细胞的再生12;ABA能够调节花芽分化时期,影响花的形成13;黄独试管苗的生长和发育受低浓度ABA的诱导,但高浓度ABA却表现出明显的毒害作用14;ABA可以调控侧根的起始基因的表达、活化侧根的分生组织15。近期关于ABA作用的研究有了更新的报道,内胚层的ABA可以促进盐胁迫调节下根系侧根(Quiescent center,QC)的细胞中细胞活性,从而影响胁迫16。水稻中的OsPYL/RCAR5可以在种子萌发和幼苗早期生长阶段起到促进作用17;Hoai Ngu
16、yen Nguyen等2013年发现TTG1调节的植物内黄酮醇的生物合成可以减弱ABA对根系生长的抑制作用18;生长素在种子休眠调控因子ABI3上游发挥作用,而且生长素的反应因子10和16通过控制ABA信号途径中的ABI3的表达调控种子休眠19,同年Rongbin Hu等研究ABA调控的种子成熟和幼苗生长时,也发现TAP46是拟南芥中调控PP2A活性的相关蛋白,从而参与了这个过程20。 Xiao等发现水稻的 WRKY13参与调控拟南芥对生物胁迫和非生物相关的响应21;大豆的WRKY13异源过表达拟南芥株系对ABA敏感度下降,侧根数目和侧根长度明显优于野生型22。近期在拟南芥中已经将WRKY定位
17、于ABA信号途径过程中,并且在种子萌发过程中发挥这重要作用23。此外,在拟南芥中,两个ABA受体(PYL/ RCAR和ABAR-ABA)是WRKY的下游组分,这些新的发现表明一些WRKY转录因子可以正向的参与ABA诱导的气孔关闭以及抗干旱胁迫24。但是WRKY转录因子在ABA信号途径其他方面的作用以及机制还一直不是很清楚,而且至今未见WRKY13参与葡萄生长的研究报道以及葡萄生长过程中WRKY13和ABA之间的关系。那么在葡萄生长过程中是否有WRKY和ABA的参与?其功能又是如何?本实验通过获得WRKY13异源表达植株,探究了葡萄WRKY13对植物生长的影响以及葡萄WRKY13异源表达植株对A
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