第十三章生物技术在植物育种中的应用.ppt
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1、第十三章 生物技术在植物育种中的应用,1、教学的基本要求 (1)了解细胞工程与作物育种的原理和基本方法; (2)了解作物的转基因技术的原理和基本方法; (3)了解分子标记的主要类型和分子标记辅助选择育种的原理和基本方法。,2、教学基本内容 第一节 细胞工程与作物育种 一、细胞和组织培养与作物育种 二、植物原生质体培养和体细胞杂交 第二节 作物育种的转基因技术 一、转基因技术的发展现状 二、*转基因育种的程序 三、转基因作物品种的选育 四、转基因作物的生物安全性 第三节 分子标记辅助选择育种 一、*分子标记的类型和特点 二、常用分子标记的原理和遗传特性 三、MAS育种方法,第十三章 生物技术在作
2、物育种中的应用 第一节 细胞工程与作物育种,植物细胞工程(plant cell engineering)是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来的一门学科。它以细胞为基本单位,在体外(in vitro)条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿生产某种物质的过程。,细胞工程与作物遗传改良有着密切关系,利用细胞工程技术已培育出一些大面积推广的品种。,早期,哈布兰特在前人细胞学说的影响下,提出高等植物的组织和器官可以不断分割,并进一步提出了植物细胞全能性(cell totipotency)理论。,植物细胞全能性是植物细胞工程的理论基础。细胞全能性是指细胞所具有的形成各种细胞类型的
3、潜在能力,也包括植物细胞经脱分化再形成植株的能力。,1904年,Hanning用萝卜的胚培养,获得小植株,为组织培养的工作奠定了基础。,1934年,White对番茄切段进行培养,建立了第一个活跃生长的无性繁殖系,获得了离体培养的真正成功。 三年后,White又发现B族维生素对培养物的生长有重要作用。,经过几年的努力,以White为主的几位科学家建立了植物组织培养(plaint tissue culture)的综合培养基,成为以后各种培养基的基础。,1948年,Skoog等发现腺嘌呤/生长素的比例是控制芽和根分化的决定因素之一,这一发现成为植物组织培养中控制器官形成的激素模式。 Miller(1
4、956)发现激动素比腺嘌呤更能促进芽的形成。,1958年,Stewart & Shautz从胡萝卜根的悬浮细胞诱导分化成完整小植株,使50多年前哈布兰特提出的细胞全能性假说首次得到科学验证,这一成果大大加速了植物组织培养研究的发展。 1964年,Guha等从曼佗罗花药培养出单倍体植株。,1970年,Kameya等利用花粉培养获得单倍体植株。 1971年,Takebe等首次从烟草原生质体获得再生植株; 1972年,Carlson等获得第一个烟草种间体细胞杂种植株。,至此,在愈伤组织水平、单个细胞水平、单个生殖细胞水平、原生质体水平和体细胞杂种水平都获得了完整植株,充分证实了植物细胞的全能性。 植
5、物组织培养流程示意图如下。,外植体来源外植体培养 愈伤组织 再生小植株再生植株,植物细胞工程的应用在20世纪60年代就已受到重视,但真正的应用研究在70年代才进入高潮。我国第一个用花药培养育成烟草品种,随后又育成了一些水稻、小麦新品种。,经济植物的快繁与脱毒、体细胞变异的筛选、新种质的创造、细胞器的移植、DNA的导入等均对作物改良和农业生产起到了促进作用。,一、 植物的细胞和组织培养技术,(一)培养基及其组成,1、培养基(Medium)的种类和特点 常用的培养基有MS、B5、White、N6、KM-8p、SH等。,2、培养基的成分 培养基中都应包括植物生长必需的16种营养元素和某些生理活性物质
6、,通常将这些物质分为三大类,即无机营养物、有机物质和植物生长调节物质(表)。,表 植物组织培养所需的养分和激素 水 有机物 大量元素 微量元素 PH 糖 N Fe Co 氨基酸 P Zn Ni 维生素 K B Al 生长素 Ca Mn Mo 细胞分裂素 Mg Cu I 调节物质 赤霉素 S 脱落酸 乙烯 酵母提取物 椰子汁 成分不定物质 植物提取物 水解酪蛋白 蛋白胨,(二)培养基的配制,1、母液的配制 为了减少配制培养基时每次称量药品的麻烦,减少极微量药品在每次称重时误差,一般先配制高浓度的储备液,即母液。,大量元素可配成10倍母液,使用时每配制1000ml培养基需要从母液中取100ml。配
7、制母液时应做到分别称量,充分溶解,在混合次序上应最后加入Ca2+,混合时要边加边混合。,微量元素因为使用量低,一般配成100倍甚至1000倍母液,使用时每配制1L培养基从母液中取10ml或1ml,配制时应注意充分溶解后再依次混合。,第三种母液即铁盐,铁盐必须单独配制,若与其它元素混合易造成沉淀。一般采用鳌合铁,即FeSO4与EDTA钠盐的混合物,一般扩大200倍。,EDTA钠盐须用温水溶解,然后与FeSO4液混合,在7580之间让其鳌合1h。使用鳌合铁的目的是避免沉淀,并使培养基能缓慢不断地供应Fe+。,第四种母液为有机化合物母液,主要是维生素和氨基酸类物质,这类物质不能配成混合母液,一定要分
8、别配成单独的母液,浓度为每毫升含0.1、1、10mg,使用时根据需要量取。,最后一种母液是激素,每种激素应单独配制母液,其浓度为0.1、0.5或1.0mg/ml。多种激素难溶于水,配制时应注意溶解次序。,IAA、NAA、GA3、玉米素先溶于少量95%酒精,再加水定容;NAA可溶于热水或少量酒精后,再加水定容;2,4-D不溶于水,可用1mol的NaOH溶解后再定容;KT和BA应先溶于少量1mol HCl中,然后定容。,表 一些植物组织培养基的成分(mg/L) - 成分 MS B5 OR White Nitsch SH Heller LS ER - 大量元素 NH4NO3 1650 - 1650
9、- 720 - - 1650 1200 KNO3 1900 2527.5 1900 80 950 2500 - 1900 1900 CaCl22H2O 440 150 - - - 200 75 440 440 CaCl2 - - 440 - 166 - - - - MgSO47H2O 370 246.5 370 750 185 400 250 370 370 KH2PO4 170 - 170 - 68 - - 170 340 NH4H2PO4 - - - - - 340 - - - (NH4)2SO4 - 134 - - - - - - - Ca(NO3)24H2O - - - 300 - -
10、 - - - NaNO3 - - - - - - 600 - - NaH2PO4H2O - 150 - 19 - - 125 - - KCl - - - 65 - - 750 - - -,- 成分 MS B5 OR White Nitsch SH Heller LS ER - 微量元素 KI 0.83 0.75 3.32 0.75 - 1 0.01 0.83 - H3BO3 6.2 3 24.8 1.5 10 5 1 6.2 0.63 MnSO44H2O 22.3 - 89.2 5 25 - 0.1 22.3 2.23 MnSO4H2O - 10 - - - 10 - - - Zn SO47H
11、2O 8.6 2 34.4 3 10 1 1 8.6 - Zn SO44H2O - - - - - - - - - Zn Na2EDTA - - - - - - - - 15 Na2MoO42H2O 0.25 0.25 1.0 - 0.25 0.1 - 0.25 0.025 MoO3 - - - 0.001 - - - - - Cu SO4 - - - - - 0.2 - - - Cu SO45H2O 0.025 0.025 0.1 0.01 0.025 - 0.03 0.025 0.0025 CoCl26H2O 0.025 0.025 0.1 - - 0.1 - 0.025 0.0025 C
12、oSO47H2O - - - - - - 0.03 - - AlCl3 - - - - - - - - - NiCl26H2O - - - - - - 0.03 - - -,- 铁盐成分 MS B5 OR White Nitsch SH Heller LS ER - FeCl36H2O - - - - - - 1 - - Fe2(SO4)3 - - - 2.5 - - - - - FeSO47H2O 27.8 - 27.8 - 27.8 15 - 27.8 27.8 Na2EDTA2H2O 37.3 - 37.3 - 37.3 20 - 37.3 37.3 NaFeEDTA - 28 - -
13、- - 1 - - -,成分 MS B5 OR White Nitsch SH Heller LS ER 有机物 盐酸吡哆醇 0.5 1 1 0.01 0.5 0.5 - - 0.5 盐酸硫胺素 0.1 10 13 0.01 0.5 5 - 0.4 0.5 烟酸 0.5 1 1 0.05 5 5 - - 0.5 肌醇 100 100 100 - 100 1000 - 100 - 甘氨酸 2 - - 3 2 - - - 2 脯氨酸 - - 1381 - - - - - - 叶酸 - - - - 0.5 - - - - 生物素 - - - - 0.05 - - - - 蔗糖 3% 2% 3% 2%
14、 2% 3% - 3% 4%,2、培养基的配制 以配制1L培养基为例,培养基配制方法如下:, 混合各成分母液。取大量元素母液100ml、微量元素母液10ml、铁盐母液5ml于一个1L烧杯中,依次加入有机成分和激素,并加水至500ml。,熔化琼脂:称78g琼脂和所需蔗糖于另一1L烧杯中,加水至500ml,待糖溶解后,加热使琼脂充分熔化。,将(1)和(2)混合,搅拌均匀,补水至1000ml。,调PH。一般用0.1mol NaOH或1N HCl调PH至所需PH。一般PH调至5.8,但也有PH调到7.0的,不同材料的最适PH不一样。对培养基的凝固来说,PH较高时,培养基过硬,不便于培养材料吸收营养;P
15、H过低,低到4.0以下时,培养基很难凝固。,分装:将培养基分装于100ml或50ml三角瓶中,每瓶50或30ml左右,封口包装。,灭菌:一般用1.1kg/cm2压力,在121下灭菌1520min。灭菌时间应根据材料掌握。时间短,灭菌不彻底;时间长,会引起培养基成分降解。,放置备用。灭菌后取出培养瓶放置在培养台上,使之冷却凝固。培养瓶应平放,以免形成斜面。,(三)无菌操作方法,1、消毒剂 在接种前,必须使材料完全无菌,这是取得植物组织培养成功的基本保证。要保证这一点,取材时应选取植物组织内部无菌的材料。从健壮植株上取材,不要有伤口;严格防止病虫。,应在晴天取材,最好中午或下午取材。最好避免选用田
16、间材料,选用无菌苗较好。非要用田间材料时,为避免消毒困难,可将材料种在大棚或生长箱里。常用的消毒剂见表。,表 植物材料消毒常用的消毒剂及使用方法 - 消毒剂 使用浓度 消除难易 消毒时间 消毒效果 (%) (min) - 次氯酸钠 2 易 530 很好 次氯酸钙 910 易 530 很好 漂白粉 饱和溶液 易 530 很好 氯化汞 0.11.0 较难 210 最好 酒精 7075 易 0.22 好 H2O2 1012 最易 515 好 溴水 12 易 210 很好 AgNO3 1 较难 530 好 抗生素 450mg/L 中 3060 较好,对于难消毒的材料,如有茸毛的、粗糙不平的材料等,在消
17、毒前,一般先用肥皂水洗,自来水冲净,在70%酒精或1L HCl中浸30s,再加入消毒剂。不同的材料消毒的方式和所需时间不一样,研究者应根据不同材料确定具体消毒方案。,2、无菌操作 准备好接种材料用的培养基、待消毒的材料、无菌水、无菌烧杯及其它必需玻璃器皿、无菌操作工具(如剪刀、镊子、解剖刀等,这些工具可用高温消毒,也可用高压高温灭菌,也可随用随消毒)、70%酒精等。,将超净工作台打开,让其运行10min左右,在超净工作台上打开烧杯和无菌水瓶盖,将HgCl2(0.1%)倒入有待消毒材料的烧杯中,510min后取出另一盛有无菌水的烧杯中,无菌水冲洗34次,然后将材料取出接种在培养基中,封口,放入培
18、养室培养。,无菌操作时应注意下面几个问题:整过操作过程一切用具必须始终保持无菌状态;无菌操作前必须用肥皂洗手,然后用70%酒精洗手;操作时无菌器皿一旦打开,应尽量避免手再从其上横过;避免强呼吸,呼吸时应将脸移开超净台;每次重新操作都要把工具在火焰上消毒,避免交叉污染。,3、无菌培养 材料接种后移入培养室培养,一般培养室要求非常卫生,恒温,有理想的光照控制系统,一般材料要求25左右,晚上一般不低于20。,二、 细胞和组织培养与作物育种,(一) 体细胞克隆变异及其育种利用,在近50年中,以植物组织培养为基础的生物技术的研究与发展为植物育种提供了一些新的实验方法和手段,并且培养出一些在生产上有利用价
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- 第十三 生物技术 植物 育种 中的 应用
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