第十五章基因重组与基因工程.ppt
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1、第十五章 基因重组与基因工程,思路: 定义 基因重组 意义 (自然) 方式:接合、转化、转导、转座 基因重组 类型 定义 基因工程 意义 (人工) 基本要素 原理 临床,第一节 自然界的基因转移和重组,一、定义: 基因重组:指细胞基因组中DNA顺序重新 排列组合的现象。 二、意义:基因变种、物种演变、进化的基础 三、方式: 接合 转化 转导 转座,1接合:指供体细胞(细菌)和受体细胞(细菌) 接触,使DNA从一个细胞转移到另一个细胞 的过程。 . 例:较大质粒在细菌间的转移 2转化:指外源DNA被引入细胞,导致其遗传和生 物性状改变的过程。 方式:自动获取外源DNA 基因重组(自然) 人为供给
2、外源DNA 基因工程 例:细菌抗药性 3转导:以病毒为媒介、将供体菌的DNA片段转移到 受体菌基因组的过程。 例:噬菌体感染宿主菌,4转座:指可移动的DNA序列(游动基因) 从基因组的 一处移动到另一处 的过程。 游动基因 介导形式 保守性转座 复制性转座 种类 插入序列 转座子 a.插入序列:转座酶基因反向重复序列 b. 转座子 定义:可从染色体一个位点转移到 另一位点的分散的重复序列。 结构:插入序列特殊序列(e.g:抗性基因),四、类型,位点特异重组:由整合酶催化,在两个DNA 序列的特异位点间发生的整合。 2.同源重组(基本重组) 定义:发生在同源序列间的重组。 (依赖DNA间同源性,
3、不是特异性) 机制: a.产生中间体 b.分解中间体,第二节 基因工程(重组DNA技术 ),一、定义:指在体外用人工(酶学)的方法, 将目的基因与载体DNA重组, 并把重组体DNA导入宿主细胞, 使目的基因扩增和表达的技术。 也称:重组DNA、重组DNA工艺学、 DNA克隆、基因克隆、重组DNA技术。 克隆(clone):指由同一个始祖经过无性繁 殖所形成的副本或拷贝集合。 克隆化 :获得同一拷贝的过程。,二、意义 扩增基因、生产蛋白、创造新种,三、基本要素 酶 目的基因 载体基因 宿主,(一)、工具酶 限制性核酸内切酶 定义:识别DNA的特异序列,并在识别 位点或其周围切割DNA双链的 一类
4、内切酶. 分类:I、II(常用)、III类 命名 II类酶 特点 识别点是DNA回文结构 切割方式 粘性末端 5粘端 3粘端 平头末端 配伍末端 识别点不同, 末端相同,(二)、目的基因 定义:是指所要研究或应用的基因。 类型:cDNA(互补DNA) 基因组DNA 来源: 化学合成 (人工合成) 基因组DNA文库 (全部基因组DNA的集合) cDNA文库 (含全部mRNA信息) PCR (聚合酶链反应),PCR:指在反应体系中加入模板、dNTP、 引物、DDRP和缓冲液;经多次(25-30) 变性、退火、延伸循环反应;使目 基因扩增(指数增长)的过程。,(三)基因载体 定义:为携带目的基因、实
5、现无性繁殖或表达 成有意义的蛋白质而采用的DNA分子。 作 用:携带目的基因进入受体细胞。 特征: 常用: 质粒DNA :pBR323 噬菌体DNA:pUC19 粘粒 病毒DNA YAC( 酵母人工染色体载体 ),四、基本原理,过程: 分、选(切)、接、转、筛、表。 1分离目的基因。(目的基因的获取) 2选择与构建基因载体。 (切割目的基因和载体基因,便于连接。) 3连接目的基因与载体。 4重组DNA转入受体菌(细胞)。 5筛选重组体。(含目的基因的受体菌或细胞)。 6目的基因的表达。 e.g: 质粒为载体进行DNA克隆,(一)、目的基因的获取 途经 1.化学合成法。 DNA合成仪 2.基因组
6、DNA文库中筛选。 限制性内切酶 3.cDNA文库中筛选。 用于分离编码蛋白的基因 4.PCR dNTP 目的基因 酶、引物、模板,(二)、克隆载体的选择和构建 a. 常用载体:质粒、噬菌体、病毒DNA。 b. 目的基因离开染色体不能复制, 需在载体 (染色体)才能复制。 c. 根据操作基因的性质、目的 对载体和目的基因进行切割。,(三)、外源基因与载体的连接 原理: 目的基因+载体 重组DNA分子 DNA连接酶 方式: 粘性末端 自然 同一酶切点的连接 (主) 不同酶切点的连接 人工 同聚物加尾连接 人工接头连接 平头连接 相同或不同酶切后连接,(四)、重组体DNA导入受体菌 方式: 转化
7、转染 感染 受体菌条件:安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态 过程:无性繁殖。 重组DNA导入受体菌,随受体菌生长、 繁殖,重组DNA分子得以复制、 扩增的 过程。,(五)、重组体的筛选 筛选(选择):将培养基中众多的转化 菌落(菌斑)分开,并鉴定 出带有目的基因的菌落的过程。 方法: 直接法 抗药性标志选择 标志补救 分子杂交法 非直接法 免疫化学法 酶联免疫检测法,(六)、克隆基因的表达 重组DNA技术目的 : 获得大量目的基因 基本目的 目的基因表达(蛋白质表达) 医药应用 蛋白表达体系 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离、纯化 意义:合成有药用价值的蛋白或多肽 方式:
8、原核表达体系 真核表达体系,五、临床,1.诊断 a. DNA诊断 b. DNA诊断的应用 产前诊断 携带者诊断 症状前诊断 预防 易感性诊断 器官移植组织配型 法医 2.治疗 a. DNA治疗(基因治疗) e.g:间接体内体细胞基因治疗(ex vivo) b. 生物制药,基本程序,1.选择治疗性基因(目的基因) 2.选择基因载体 3.选择靶细胞(受体细胞) 4.基因转移(外源基因导入受体细胞)。 间接方式 病毒载体 5.筛选外源基因(利用标记物) 6.回输体内(以不同方式回输获得 治疗性基因修饰后的细胞),一、接合作用(conjugation) 当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接 触时,质粒D
9、NA从一个细胞(细菌)转移至 另一细胞(细菌)的DNA转移称为接合作用。,二、转化作用(transformation) 通过自动获取或人为地供给外源DNA, 使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。,三、转导作用(transduction) 当病毒从被感染的细胞(供体) 释放出来,再次感染另一细胞(受体) 时,发生在供体细胞与受体细胞之间 的DNA转移及基因重组。,图 15-3 转导作用,转导:通过病毒介导发生在供体细胞与受体细胞 之间的DNA转移及基因重组,插入序列转座 插入序列(insertion sequences,IS): 长750 1500bp 组成: 反向重复序列:941bp,位于
10、两侧 转座酶编码基因:产物引起转座,位于中间 正向重复序列:412bp,位于反向重复序列 外侧,为插入序列所特有,转座: 1. 保守性转座 从原位迁至新位 2. 复制性转座 插入序列复制后,一个复制本迁到 新位,另一个保留在原位。,保守性复制,插入序列,+,反向重复序列,+,靶位点,内切酶裂解,(转座酶),切端形成新的磷酸,二酯键 (转座酶),新 DNA (poly I) 合成,与连接 (转座酶),位点特异的,重组 (转座酶),老定位,新定位,图 15-4 插入序列的复制性转座,3,3,5,5,3,5,3,5,转座子转座 转座子(transposons):可从一个染色体 位点转移到另一位点的分
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- 第十五 基因 重组 基因工程
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