第十五章核酸的研究方法.ppt
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1、第十五章 核酸的研究方法,1、核酸的分离、提纯和定量测定,DNA的分离 RNA的分离 核酸的定量,Isolation of Nucleic Acids,Goals: removal of proteins DNA vs RNA isolation of a specific type of nucleic acid,Types of Methods: differential solubility adsorption methods density gradient centrifugation,Types of DNA: genomic (chromosomal) organellar (
2、satellite) plasmid (extra-chromosomal) phage/viral (ds or ss) complementary (mRNA),General Features: denaturing cell lysis (SDS, alkali, boiling, chaotropic) enzyme treatments protease RNase (DNase-free) DNase (RNase-free),Collection of cells,Use soft brushes to dislodge epithelial cells lining the
3、mouth.,Ample cell collection is very critical for success.,Whats in Lysis Buffer? Tris buffer to maintain pH of solution so that DNA is stable SDS to dissolve membranes of cell, allowing DNA to be released into solution SDS also denatures proteins, making them more susceptible to protease cleavage,L
4、ysis buffer,Why add Protease?,Protease destroys nuclear proteins that bind DNA, and cytoplasmic enzymes that breakdown and destroy DNA (nucleases) Protease treatment increases the yield of DNA,Adding salt (5M NaCl),Na+ binds to phosphate groups of DNA, neutralizing the electric charge of DNA NaCl al
5、lows DNA molecules aggregate instead of repelling each other, making it easier for DNA to precipitate out of solution when alcohol is added,Adding ice cold alcohol,DNA cannot dissolve in alcohol The addition of cold alcohol makes the DNA clump together and precipitate out of solution Precipitated DN
6、A molecules appear as long pieces of fluffy, stringy, web-like strands,Microscopic oxygen bubbles “aggregate” or “fuse” together, simultaneously with the DNA precipitation The larger, visible air bubbles act to “lift” the DNA out of solution, from the aqueous into the organic phase,DNA Precipitation
7、,High MW Genomic DNA Isolation,Typical Procedure Cell Lysis 0.5% SDS + proteinase K (55o several hours) Phenol Extraction gentle rocking several hours Ethanol Precipitation RNAse followed by proteinase K Repeat phenol extrac-tion and EtOH ppt,Phenol Extraction mix sample with equal volume of sat. ph
8、enol soln retain aqueous phase optional chloroform/isoamyl alcohol extraction(s),High MW Genomic DNA Isolation,Typical Procedure Cell Lysis 0.5% SDS + proteinase K (55o several hours) Phenol Extraction gentle rocking several hours Ethanol Precipitation RNAse followed by proteinase K Repeat Phenol Ex
9、trac-tion and EtOH ppt,EtOH Precipitation 2-2.5 volumes EtOH, -20o high salt, pH 5-5.5 centrifuge or spool out,Isolation of RNA Special Considerations,RNAse inhibitors! extraction in guanidine salts phenol extractions at pH 5-6 (pH 8 for DNA) treatment with RNase-free DNase selective precipitation o
10、f high MW forms (rRNA, mRNA) with LiCl oligo-dT column,2、核酸的沉降特性,通常很难分离出完整DNA分子,但可得到分子量不太大的环状DNA,这类制剂包括: 共价闭环DNA:常呈超螺旋型 开环DNA:双链环状DNA的一条链断裂,分子呈松弛态 线型DNA:环状DNA的双链断开,在超速离心机造成的离心力场中,溶液中的核酸下沉的速率会大大加快,这是核酸的沉降特性,该技术可研究: 核酸在溶液中的构象 测定核酸的沉降系数和相对分子量,氯化铯密度梯度沉降平衡超离心法,核酸密度测定 测定DNA中G-C之含量 溶液中核酸构象的研究 用于核酸的制备,Densi
11、ty Gradient Centrifugation,rate zonal/sucrose (size fractionation) electrophoresis more common isopycnic/CsCl (density) DNA 1.7 g/cm3 protein 1.3 g/cm3 RNA DNA ssDNA dsDNA GC content,CsCl Gradients,Applications large scale preparations high purity satellite DNA RNA cushions,CsCl Gradients,三、核酸的凝胶电泳,
12、凝胶电泳兼有分子筛和电泳的双重效果,不纯核酸样品: 琼脂糖凝胶电泳分离出区带 溴化乙锭染色 紫外灯下粗略估计含量,电泳迁移率取决于:,核酸分子大小 胶浓度 DNA的构象 电流 碱基组成 温度,凝胶电泳的样品可进行回收,聚丙烯酰胺作为支持物 孔径小于丙烯酰胺 可分析小于1000bp的DNA片断,聚丙烯酰胺凝胶电泳,4、核酸的核苷酸序列测定,DNA一级结构的测定,Sanger发明的末端终止法 M. Maxam和W. Gilbert 发明的化学断裂法 焦磷酸测序 。 前两种方法一般都会用放射性32P对DNA进行标记,需要使用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对长度不同的核酸片段进行分离,分离以后还需要使用放射
13、自显影的技术进行观察和分析。目前已普遍使用荧光物质代替放射性同位素对DNA进行标记。焦磷酸测序是新一代DNA序列分析技术,该项技术无需电泳,DNA片段也无须荧光标记,操作极为简便。,末端终止法,末端终止法也叫双脱氧法。要想理解此方法的原理,需要对DNA复制的过程有所了解。DNA是一种双螺旋分子,其复制是在DNA聚合酶催化下,以原来的两条母链上的核苷酸序列为模板,通过互补配对的方式合成新DNA链的过程。复制需要引物和四种dNTPs,总是从5-端向3-端进行。细胞内DNA复制的引物一般是RNA,但体外DNA复制的引物可以是人工合成的与模板链互补的一段寡聚脱氧核苷酸。复制开始于引物3-端自由的羟基,
14、依据碱基互补配对的原则,不断地形成新的3,5-磷酸二酯键,使DNA链得到延伸,直到一个新的DNA分子完全被合成。,末端终止法,进行四组平行反应 每一组反应混合物含有dATP, dGTP, dCTP和dTTP,有一种被32P标记 每一组反应含有一种少量的ddATP或ddGTP或ddCTP或ddTTP。 在多数情况下,聚合酶使用正常的核苷酸,DNA合成正常延伸。 有时,聚合酶使用ddNTP,而导致末端终止。 每一组反应中ddNTP的随机插入留下一系列长度不等的以该双脱氧核苷酸结尾的DNA链。 对每一组反应混合物走凝胶电泳。 片段越短,走的越快,就越靠近凝胶的底部。 从凝胶的底部向上读出序列。 将读
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