第十六细胞因子与细胞粘附因子的测定.ppt
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1、第十六章 细胞因子与细胞粘附因子的 测定 第一节 生物学测定方法 一、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法 二、细胞毒活性测定法 三、抗病毒活性测定法 四、趋化活性测定法 五、生物学活性测定方法学评价 第二节 免疫测定方法 一、ELISA方法 二、流式细胞分析法 三、酶联免疫斑点试验 四、免疫学测定方法学评价 第三节 细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用 一、临床应用原则 二、特定疾病诊断的辅助指标 三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后 思考题 小结 是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分 泌的活性物质,其主要生物学功能是介导和调节 免疫应答及炎症反应,其化学本质是蛋白质或多 肽。 细胞因
2、子 细胞粘附因子 是介导细胞间及细胞与细胞外基质间粘附作用 的分子,其化学本质为糖蛋白,可以细胞膜表面表 达和可溶性两种形式存在。 第一节 生物学测定方法 1.基于DNA检测的分子生物学测定法: DNA扩增法 RNA印迹法 原位杂交法 核酸酶保护分析 2.生物活性测定法 生物学测定法分类 根据细胞因子特定的生物学活性,应用相应的指示 系统,同时与标准品对比测定,从而得知样品中细 胞因子的活性水平,一般以活性单位(U/ml)表示 生物活性测定法原理 有助于细胞因子 检测的活性作用 刺激细胞增殖或集落形成的活性维 持细胞生长和存活的特性 抑制细胞生长或破坏细胞的效应促 进细胞趋化或抗病毒作用 以细
3、胞因子依赖性细胞株为靶向,通过观 察特定的细胞因子刺激或抑制依赖性细胞 株增殖来评估细胞因子的活性水平。 一、促进细胞增殖和增殖抑制测定法 直接计数法 简便、直观,但费时、主观因素影响大、难 以标准化和自动化 细胞代谢活性测定方法 3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT等比色法 细胞代谢产物测定法 代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标 记或可溶性分子测定法 细胞增殖检测方法分类 通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在 细胞的增殖过程中,DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需 求增多,若将核苷标记上可以示踪的同位素(3H/125I ),通过检测 细胞内的同位素含
4、量,则可反映细胞增殖的程度。 结果客观易于自动化; 适用于大标本量的测定 方法的特异性受依赖细胞 株影响;放射性污染 (1) 放射性核素掺入法 常见细胞因子3H-TdR掺入检测法所需细胞及参考试验条件 细 胞 株所需浓度(细胞数/ml) 3H-TdR前培养时间3H-TdR后培养时间 检测细胞因子 D10G4.121054818-20IL-1 L92921055616IL-1 CTLL-2105244-6IL-2 FDC-P1,32DCL-275104244-8IL-3 CT.4S105244-6IL-4 CH125103486IL-5 B1351043612IL-5 T88-M11052412
5、IL-5 BCL1105726IL-5 Clone-K,IN/2bx105244-6IL-7 TS13104666IL-9 T10105726IL-11 UT-71.5105726 SCF (干细胞因子) CCL-64*5108728TGF- DA3.15, IF5104244-8GM-CSF M14/NES60.45104244-8M-CSF/G-CSF 特点:不使用放射性核素, 以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关 测定步骤类似 与同位素掺入法相比 掺入物:MTT而非3H-TdR; 反应条件:选用的细胞及其浓度、 培养时间不同 (2) MTT 比色法 细胞株/原
6、代细胞细胞终浓度(细胞数/ml)加入MTT前温育时间(h)检测细胞因子 B9,MH60,BSF2,TTD15104/210596/48IL-6 B9-11510496IL-11 B9-1-3510496IL-13 KYM-1D4210372 MV-3D95103120TGF- WEHI-164/clone13210372TNF 32D/Mp110S110344 L929210556TNF CTLL-210522-24IL-2 小鼠基质细胞, 32DCL-271.510572IL-3 细胞增殖或抑制活性检测的MTT比色法常用靶细胞 对指示细胞具有破坏作用的细胞因子,若与细胞共育将会导致细胞死亡。
7、 因此,待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系,以检测培养细胞 的死细胞数作为判断指标,死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。试验时,与 细胞增殖或抑制方法一样,以已知活性的细胞因子标准品为对照。死、活细胞 情况可用同位素51Cr释放法判断,或应用台盼兰染色死细胞后直接计数。也可 通过结晶紫、萘酚蓝黑、MTT、NBB等着染活细胞,再用脱色液脱出染料后酶标 仪比色测定吸光值。死细胞数、51Cr释放量越高或比色测定的吸光值越低,表 明待测细胞因子的细胞毒活性则越高。应用系列稀释的细胞因子标准品,制作 其活性与剂量关系的标准曲线,以此作为待测品活性的定量测定的基础。 本法常用于TNF等的测定 二
8、、细胞毒活性测定法 基本原理 Wish、Hep2/c 人干扰素 L929 小鼠干扰素 Ratec 大鼠干扰素 A549 MDBK 多种族的IFN-和IFN- 本法常用于IFN等的测定,IFN可诱导细胞产生抑制病毒 RNA和DNA合成的酶,保护细胞不受病毒感染,产生细胞病 变效应(CPE)。 VSV、EMCV及Sindbis virus等 细胞病变效应(CPE)、 抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量 三、抗病毒活性测定法 常用于检测抗病毒活性的细胞株 常用于攻击细胞的病毒 检测抗病毒活性的方法 TNF-和TNF-与同一受体结合,故两者生物学活性相似 用TNF-与TNF-特异性中和抗体作阻断试验,以
9、区别两类TNF TNF活性测定靶细胞:小鼠成纤维细胞株L929、L-M、WEHI164.13 注意: 若选用L929细胞,其不宜生长过密。 细胞被某种因素激活后,代谢增强,线粒体脱氢酶活性也增强, 着色也会加深。 MTT染色时,必须考虑待检样品中有无激活靶细胞的因素。 细胞毒活性测定法常用于TNF等的测定 细胞病变程度分为5个等级 ,即: “0”,表示无明显CPE; “1+”,CPE25; “2+”,CPE为2550; “3+”,CPE为5075; “4+”,CPE为75100。 根据病变程度找出CPEI50的标 本稀释范围,并以此计算出距 离比例和确定IFN效价。 该法操作复杂、影响因素较
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