第章基因工程.ppt
《第章基因工程.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《第章基因工程.ppt(81页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、1,第十四章,基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering,Xiu-feng Gao West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University,2,一、自然界的基因转移和重组:接合作用,转化、转导作用,噬菌体DNA的整合, 细菌的特异位点重组,转座重组,同源重组,插入序列的结构特点,转座子的结构特点。 二、重组DNA技术 相关概念: 克隆,基因工程,工具酶,目的基因,基因载体 基本原理和过程: 目的基因的获取,克隆载体的选择和构建,外源基
2、因与载体的连接,重组DNA的导入,重组体的筛选,克隆基因的表达。,主要内容,3,第一节 细菌的基因转移和重组 Bacterial Gene Transfer and Recombination,.接合作用(conjugation) 当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时,质粒DNA就可从一个细胞(细菌)转移到另一个细胞(细菌),这种类型的DNA转移称为接合作用。,质粒 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,一、细菌的基因转移,4,F factor: 含有细菌性鞭毛蛋白的编码基因.,5,2 转化作用(transformation),通过自动获取或人为地供给外源DNA,使细胞或培养的受体细胞获得新
3、的遗传表型,称为转化作用。,例:溶菌时,裂解的DNA片段被另一细菌摄取。,6,溶菌生长途径(lysis pathway): 噬菌体感染宿主时,噬菌体DNA在宿主内迅速增殖,产生新的病毒颗粒,溶解细菌,释放出新生噬菌体。,溶源菌生长途径 (lysogenic pathway): 噬菌体感染宿主时,噬菌体DNA整合进宿主染色上,随宿主复制而复制。,当遇到DNA损伤时,噬菌体(原噬菌体)从宿主菌(溶原菌)染色体上脱下来,进入溶菌生长途径。,转导作用 (transduction),7,3. 转导作用(transduction),当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来、再次感染另一(供体)细胞时,发生在供
4、体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。,8,二、 DNA重组 ( DNA recombination),同源重组 (homologous recombination),特异位点重组 (site-specific recombination),定义:不同DNA分子间发生的共价连接或DNA分子内较大片段的交换称为重组或重排。,转座重组 (transposition recombination),自然界的基因转移和重组,9,发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination),它通过链的断裂和再连接,在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交
5、换,又称为基本重组。 是最基本的DNA重组方式:,以E.coli的同源重组为例,了解同源重组机制。,(一)同源重组,10,Holiday中间体,11,Holiday中间体,片段重组体,拼接重组体,C,12,同源重组关键步骤, 同源联会的两个DNA分子的任意一个DNA出现单链切口; 两个单链对接,形成半交叉; 半交叉分支移动(branch migration)产生异源双链DNA; 形成Holliday中间体,Holliday中间体的变构和拆分。,片段重组体(patch recombinant) 切开的链与原来断裂的是同一条链,重组体含有一段异源双链区,其两侧来自同一亲本DNA。,拼接重组体(sp
6、lice recombinant) 切开的链并非原来断裂的链,重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,13,(二)位点特异重组 位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化,在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。,整合酶(intergrase, Int): 是噬菌体DNA编码的产物,是一种DNA结合蛋白,对噬菌体的的重组位点attP有强的结合力,催化attP和细菌重组位点attB之间的重组。,整合宿主因子(intergration host factor, IHF):细菌编码的产物。,切离酶(Xis): 噬菌DNA编码的产物.,1. 噬菌体DNA
7、的整合,14,噬菌体DNA的整合,15,2.细菌的特异位点重组,沙门氏菌H片段倒位导致鞭毛相转变 导致H1抗原和H2抗原的交替表达,16,H片段有两个特异重组位点(hix) 为反向重复序列 H片段上有两个启动子P 其一驱动hin基因表达 H片段可在Hin和Fis控制下进行特异位点 重组(倒位)。 另一正向时驱动H2和rH1基因表达 rH1为H1的阻遏蛋白基因。 H片段反向(倒位)时H2和rH1不表达,H1表达。,H片段倒位导致鞭毛相转变要点,17,3.免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白(Ig),由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成,分别由三个独立的基因族编码,其中两个编码轻链(和),一个编码
8、重链。,RSS,RSS,RSS,18,重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游,J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基因rag (recombination activating gene)共有两个,分别产生蛋白质RAG1和RAG2。,19,V片段,J片段,RSS,RSS,间插DNA,OH,OH,分子内转酯反应,单链切开 转移核苷酸 修复、连接,免疫球蛋白基因重排过程,目 录,V片段,J片段,20,(三)转座重组(transposi
9、tion recombination) 定义:由插入序列(insertion sequences,IS)和转座子(transposons)介导的基因转移或重组。,(1)IS转座,IS转座发生形式: 保守性转座:IS由原位到新位。 复制性转座:IS复制后,复制本迁到新位到, 另一个留在原位。,IS特征:IS两侧有二个分离的反向重复序列(inverted repeats, IR) 一个转座酶(transposase)编码基因 IS插入靶位点的两侧产生正向重复序列(derect repeat, DR),IR,Transposase Gene,IR,DR,DR,21,IS,靶位点,靶位点粘性末端切割,
10、IS和靶位点共价连接,复制修复缺口形成DR,IS保守性转座,IR,IR,IR,IR,DR,DR,IS,22,插入序列的复制性转座,23,可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。 转座子组成:反向重复序列 转座酶编码基因 抗生素抗性等有用的基因,(2)转座子转座,24,25,第二节 重组DNA技术,重组DNA技术是对携带遗传信息分子进行设计和改造的分子工程,包括基因重组、克隆和表达。也就是人工操作基因的过程。,实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程,又称重组DNA工艺学。,26,一、重组DNA技术相关概念,克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程
11、称为克隆化(cloning),即无性繁殖。,技术水平:分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆(动物或植物),27,目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白),DNA克隆 (DNA cloning) 应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质(同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA)与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon),继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增提取获得大量同一DNA分子,也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA)
12、 。,28,(二)工具酶,29,限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE),型酶 型酶,识别位点与切割位点不一致; 没有固定的切割位点; 不产生特异性片段;,型酶,识别位点是特异的; 切割位点位于识别位点中或附近; 产生特异性片段; 是最常用的工具酶。,功能:能特异水解双链DNA的磷酸二酯键。,有特异切割位点; 切割位点在识别位点以外;,30,第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写; 第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写; 第四个字母代表株或型; 用罗马数字表示发现的先后次序。,Hind ,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌
13、d株的第三种酶,限制性核酸内切酶命名,31,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE),定义:是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,作用特点:识别序列有特异性; 大多数识别位点具有回文结构 酶解后产生特征性切口 平端切口 5末端突出粘性末端切口 3末端突出粘性末端切口,32,形成特征性切口,33,1. 大多数酶是识别顺序不同,切割方式也不同。 2.同尾酶:有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切割DNA后,产生相同的粘性末端,称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。,34,3.同功异源酶 来源不同的限制酶,但能识
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 基因工程
链接地址:https://www.31doc.com/p-2276050.html